Este trabajo fue financiado por el NIH R01EY020560-01 y por una beca WM Keck jóvenes en el Premio de Investigación Médica. Los autores desean agradecer a José Bedont por su ayuda durante el estudio de las preparaciones de retina y las inyecciones.

1. Preparación de plásmidos para la electroporación La concentración de ADN necesarias para la electroporación es 5μg/μl. Esto requiere típicamente los plásmidos deseados que se amplifica con un Maxi-prep (Qiagen) o un método equivalente seguida por una purificación y concentración del ADN a la cantidad de trabajo. Los pasos siguientes describen la preparación de ADN a la cantidad de trabajo. <ol><li> Alícuota de 100 ug de ADN (de Maxi-prep o equivalente) y se diluye el volumen de 100 L para la facilidad de manipulación. </li><li> Añadir fenol, la cantidad de fenol se debe calcular para obtener una aproximadamente el 60% del ADN / volumen (ADN mg: volumen total), es decir: 100 mg de ADN (en 100 l), además de 67 l de fenol (mg 100: 167 l). Mezclar bien, no pipeta hacia arriba y abajo, ya que puede causar una ruptura excesiva de la DNA. </li><li> Girar el ADN durante 5 minutos a 14.000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Recoger el líquido sobrenadante y añadir cloroformo utilizando el mismo ADN: la relación de volumen total en el paso 1.2; mezcla como se describe en el paso 1.2 y giran a 14.000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Recoger el sobrenadante, añadir 10% de volumen sobrenadante de acetato de sodio 3 M a la solución de ADN, mezclar suavemente y añadir 2,5 veces el volumen del sobrenadante de etanol al 100%. Mezclar por inversión. ADN se precipitan fuera de la solución durante la mezcla. </li><li> Girar el ADN a 4 ° C durante 10 minutos a 14.000 RPM. </li><li> Enjuagar con 350 l de etanol al 70%, giran a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Deje secar al aire el precipitado se disuelve el ADN de un X PBS (grado de Biología celular) a 5μg/μL. No resecar la muestra, ya que esto lo hacen muy difíciles de disolver en PBS. </li><li> Agregar colorante verde rápido (10% de acciones) a la solución de ADN, la concentración final de tinte es de 0,1%, para actuar como un indicador de inyección. </li></ol> 2. Inyección subretiniana de ADN Los pasos siguientes se realizan con la ayuda de un microscopio estereoscópico. Una vez practicado el proceso de apertura de los ojos, la incisión, y la inyección en menos de 1,5 minutos, lo que no es tiempo suficiente para que un cachorro adecuadamente anestesiado para recuperar. El uso de un fuerte de calibre 30 agujas, abra cuidadosamente el ojo cortando a lo largo del epitelio de la unión fundida (Fig. 1C). No aplique una fuerza excesiva ya que esto puede resultar en el corte del ojo subyacente. Evite cortar más allá del alcance de la unión del párpado ya que esto dará lugar a hemorragias que pueden oscurecer la inyección. <ol><li> Anestesiar a los ratones recién nacidos en el hielo durante varios minutos (Fig. 1A), no se entierran las crías en el hielo ya que esto puede provocar la muerte. La longitud de tiempo en el hielo es variable desde cachorro a las crías, por lo general de 5 minutos es suficiente, pero los ratones deben ser monitoreados cuidadosamente como los individuos pueden responder muy rápidamente, o puede requerir una mayor exposición a garantizar la anestesia adecuada. Llevar a cabo una pizca de pata con pinzas hemostáticas para comprobar si hay reflejo de retirada. </li><li> Con el fin de facilitar la inyección de ADN al espacio subretiniano el primer ojo debe estar abierto. Limpie el ojo para ser inyectado con un 70% de preparación alcohol isopropílico (Tyco Healthcare) e identificar el epitelio de la unión fundida en los dos párpados se juntan (Fig. 1B). </li><li> El uso de un fuerte de calibre 30 agujas, abra cuidadosamente el ojo cortando a lo largo del epitelio de la unión fundida (Fig. 1C). No aplique una fuerza excesiva ya que esto puede resultar en el corte del ojo subyacente. Evite cortar más allá del alcance de la unión del párpado ya que esto dará lugar a hemorragias que pueden oscurecer la inyección. </li><li> Para facilitar la penetración de los ojos por la aguja roma terminó inyección utilice la punta de una aguja de calibre 30 hace una pequeña incisión en la esclera cerca del cruce con la córnea (Fig. 1E). No penetran muy profundamente, ya que puede dar lugar a una punción de la lente. </li><li> Dibuja 0,3 l de solución de ADN en un 33 calibre contundente aguja de inyección terminó con los gradientes de la jeringa para medir el volumen de forma individual por cada inyección (aguja de diámetro exterior de 0,52 mm, diámetro interior de 0,13 mm; Exmire microjeringa; Ito corp). Insertar la aguja en la incisión hasta que la resistencia de la pared opuesta escleral se siente. Tenga cuidado de no penetrar la lente cuando la aguja pasa a través de la cámara vítrea (Fig. 2B). </li><li> Inyecte lentamente 0,3 l de solución de ADN en el espacio subretiniano usando el dedo índice o el pulgar para presionar el émbolo de la jeringa. El experimentador debe tener cuidado de controlar la velocidad de la depresión del émbolo de modo que la velocidad a la que se inyecta la solución de ADN en el espacio subretinal no superan la velocidad a la que la solución de ADN se extiende en el espacio subretinal (Fig. 2C). La solución de ADN es muy viscoso por lo que es importante que la aguja no se presiona con demasiada fuerza contra la pared opuesta escleral ya que esto puede resultar en el ADN no se inyecta o no se propaga de manera uniforme. Una inyección de éxito dará lugar a una aúndifusión de la solución de ADN en una porción del espacio subretiniano. Regiones de la retina con y sin base marcador verde debería ser evidente cuando se gira el animal inyectado. </li></ol> 3. Electroporación <ol><li> La electroporación se realiza mediante un electrodo de 10 mm de diámetro con pinzas (Modelo # 522; Instrumentos BTX). Sumerja el electrodo en la pinza de PBS con el fin de maximizar la conductividad eléctrica del electrodo para el animal y el lugar de la cabeza del cachorro inyectado entre los electrodos con los ojos inyectados adyacente al electrodo polo positivo y el ojo no inyecta junto al polo negativo electrodo (Fig. 3B). </li><li> Aplique cinco pulsos cuadrados con un generador de impulsos: cada pulso es de 80 voltios y 50 milisegundos de duración con un intervalo de 950 milisegundos entre los pulsos. </li><li> Los cachorros electroporated ahora debe ser calentado hasta que se recupere de la anestesia de hielo. Esto se puede hacer mediante la colocación de los cachorros en una lámpara de calentamiento o en la parte superior de una diapositiva más cálido. Si se utiliza una diapositiva más cálido asegurarse de que una plataforma adecuada se coloca entre la superficie del metal y el cachorro se recupera. Tras la recuperación de volver a los cachorros electroporated a su madre. </li></ol> 4. Preparación de los ojos para el análisis <ol><li> El momento de la recolección y el análisis de las retinas electroporated se lleva a cabo con sujeción a los objetivos del experimento. La expresión de GFP puede ser extremadamente visualizar tres días después de la electroporación. Para cryoembedding y corte haga lo siguiente. </li><li> Sacrificio de animales por electroporación en el punto de tiempo deseado. Diseccionar el ojo electroporación y fijar en el 4% de paraformaldehído a 4 ° C durante 50 minutos. </li><li> Retire con cuidado la retina del ojo por micro-disección de distancia de la esclerótica, córnea, el cristalino, la coroides y epitelio pigmentario retiniano. Las retinas disecados pueden ser analizados bajo fluorescencia para determinar enormemente la eficiencia de la electroporación. Transferencia de las retinas de solución de sacarosa al 30% de la noche a 4 ° C. </li><li> Congelar la retina en octubre crio-incrustación de los medios de comunicación (Sakura Finetek EE.UU.) y almacenar a -80 ° C. Retinas ahora puede ser seccionado en un cryotome y capturado en portaobjetos de vidrio. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Ejemplos de P0 retinas neonatal electroporated con un plásmido de expresión pCAG-EGFP se presentan en 3 días después de la electroporación (P3) y 14 días después de la electroporación (P14) en la figura 4. La zona de tejido de la retina electroporación es variable de experimento a experimento en función de la magnitud del daño tisular se haya incurrido durante la inyección y la uniformidad de la propagación de la solución de ADN en el espacio subretiniano. Normalmente, el 90-100% de retinas electroporated contará con las células que han incorporado con éxito y expresó el plásmido introducido. Sin embargo, cuando se toma en morfología de los tejidos y la eficiencia de electroporación sólo el 40-60% de las retinas de electroporación son adecuados para el análisis comparativo. Formación de rosetas y desprendimiento de retina en el sitio de penetración de la aguja es casi siempre observado y esta región no se debe utilizar para el análisis. ADN exitosa difusión en los resultados de microinyección en el tejido de manera eficiente electroporated lateral al sitio de penetración de la aguja libre de rosetas y el desapego. Gliosis es también una preocupación importante experimental y casi siempre ocurre en el sitio de penetración de la aguja. Sin embargo, como con formación de rosetas y desprendimiento de retina, gliosis no suele ser significativa en el tejido lateral electroporación. Marcadores inmunohistoquímicos como la proteína ácida glial fibrilar (GFAP) se puede utilizar para determinar si los niveles de gliosis reactiva en las regiones analizadas caen dentro de límites aceptables. Retinas seccionado lo que demuestra que la morfología de la retina electroporated se mantiene intacto y que las etiquetas EGFP expresión individual electroporated células se presentan. Ejemplos 3 días siguientes a la electroporación P0 (Fig. 4A-C) y 14 días después de una electroporación P0 (Fig. 4D-F) se presentan. En las retinas de P3 a la mayoría de las células por electroporación se encuentran en la capa de neuroblástico (NBL) de la retina, y no demuestran distintas características morfológicas de cualquiera de las células diferenciadas neuronales o gliales de la retina (Fig. 4B, C). Por P14 células por electroporación se puede encontrar en la capa nuclear externa (ONL) y la capa nuclear interna (INL) de la retina. Además, la presencia de varias células etiquetadas ahora muestran señas de identidad características morfológicas de las neuronas diferenciadas como las interneuronas de la INL, los fotorreceptores y las células de Müller (Fig. 4E, F). <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Anestesia de un recién nacido (P0) cría de ratón y la apertura de los ojos para inyección subretiniana de solución de ADN. A) Neonatal cachorro puesto enuna cama de hielo picado para anestesia. Ojo que se inyecta se pone abajo contra el hielo. B) La ubicación del epitelio de unión fusionada (B, flecha) de los párpados que cortar para abrir los ojos. C) El corte de los párpados a lo largo del epitelio de unión fusionada (C, flecha) para exponer a los ojos. D) Los ojos abiertos después del corte en la unión fundida. E) Se hace una incisión en el ojo por debajo de la esclerótica por debajo de la córnea para facilitar una fácil inserción de los romos de micro-inyección de la jeringa. Las barras de escala, B, C, D, E: 4mm. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Inserción de la figura 2. Romos de la micro-inyección de la jeringa y la inyección de solución de ADN plásmido en el espacio subretiniano. A) Esquema de dibujos animados que demuestran la correcta inserción de la jeringa de inyección de micro en el ojo y la liquidación de la punta de la jeringa en el espacio subretiniano. La inyección de la solución de ADN en la cámara vítrea, la aprobación de la jeringa a través del ojo en el zócalo, o la inyección en la lente se traducirá en experimentos fallidos con pocas o ninguna las células por electroporación. B) La penetración de la aguja en la incisión en la pared escleral y la liquidación de la punta de la jeringa en el espacio subretiniano. C) La inyección de la solución de ADN en el espacio subretiniano. Las barras de escala, B, C: de 4 mm. Abreviaturas de la siguiente manera: R-retina, lente L, V-vítreo, el espacio SRS-subretinal, BES-romos jeringa. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Orientación del electrodo de pinza en el ratón por electroporación. A) Esquema de dibujos animados que demuestran la orientación de las palas positivos y negativos de la pinza del electrodo con respecto al ojo electroporación. El verde representa la ubicación de ADN se inyecta en el espacio subretiniano. Flechas discontinuas representan el movimiento electroforético de ADN cargado negativamente inyectada hacia el electrodo positivo. Electroforesis de ADN se produce desde el espacio subretiniano adyacente al electrodo negativo en la retina, que está orientada hacia el electrodo positivo. B) La pala positivo de la pinza se coloca junto a la microinyección de ADN del ojo y la paleta negativo se coloca al lado del ojo no se inyecta. C) Ampliación de imagen en alta de la colocación de las pinzas de electrodos en el ratón recién nacido. Las líneas discontinuas representan la dirección del movimiento electroforético de ADN hacia el electrodo positivo. Escala de barras, C: 5 mm. <img src="/files/ftp_upload/2847/2847fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Neonatal del ratón retinas (P0) a electroporación con pCAG-EGFP y se analizaron en el día postnatal 3 (P3) y el día postnatal 14 (P14). AC) Confocal de imágenes de la retina P3 seccionado electroporación con pCAG-EGFP en P0. La mayoría de las células por electroporación se sientan en la capa de la retina neuroblástico (NBL). (DF) Confocal de imágenes de un seccionado P14 retina electroporación con pCAG-EGFP en P0. Electroporated células pueden ser identificados en la capa nuclear externa (ONL) y la capa nuclear interna (INL) de la retina. Las barras de escala, AF: 50 micras.

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	<li>Neumann, E., Rosenheck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+changes+induced+by+electric+impulses+in+vesicular+membranes.">Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).</li><li>Turnbull, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Letter:+Letter:+An+alternate+explanation+for+the+permeability+changes+induced+by+electrical+impulses+in+vesicular+membranes.">Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes.</a> J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).</li><li>Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+ion+flow+in+Escherichia+coli+B+and+electrical+sizing+of+bacterias.">Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias.</a> Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).</li><li>Kinosita, K., Tsong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-induced+pore+formation+and+hemolysis+of+human+erythrocytes.">Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes.</a> Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pias3-dependent+SUMOylation+directs+rod+photoreceptor+development.">Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development.</a> Neuron. 61, 234-246 (2009).</li><li>Onishi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orphan+nuclear+hormone+receptor+ERRbeta+controls+rod+photoreceptor+survival.">The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).</li><li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Core+Paired-Type+and+POU+Homeodomain-Containing+Transcription+Factor+Program+Drives+Retinal+Bipolar+Cell+Gene+Expression.">A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression.</a> J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li></ol>

En vivo electroporación representa un método rápido y eficaz para la transformación de células de la retina con plásmidos de expresión de ADN. Este método permite al investigador para llevar a cabo estudios de ganancia de función por ectópica introducción de un gen de interés bajo el control de un promotor de expresión ubicua o para realizar estudios de pérdida de función mediante el uso de las construcciones del shRNA objetivo genes de interés. Además, múltiples plásmidos de ADN puede ser el...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Buffer de fenol saturado </td><td> Invitrogen </td><td> 15513-039 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Cloroformo </td><td> JT Baker </td><td> 9180-03 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Acetato de sodio </td><td> JT Baker </td><td> 3470-05 </td><td> 3 M de valores </td></tr><tr><td> Fast Green FCF </td><td> Fisher Biotecnología </td><td> BP123-10 </td><td> 10% de acciones </td></tr><tr><td> El alcohol isopropílico preparación </td><td> Tyco Healthcare </td><td> 6918 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 30 de calibre de aguja </td><td> Terumo Medical Corp. </td><td> SG2-3013 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Exmire microjeringa </td><td> Ito Corporación </td><td> MS * E05 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Tweezertrode (electrodo pinza) </td><td> BTX instrumento, Genetronics Inc. </td><td> 522 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Electro Plaza del evaporador (electroporador) </td><td> BTX instrumento, Genetronics Inc. </td><td> ECM 830 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Compuesto octubre </td><td> Sakura Finetek EE.UU. </td><td> 4583 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of developing mouse retina

La caracterización funcional de genes expresados ​​durante el desarrollo de la retina de mamíferos sigue siendo un reto importante. La orientación de genes para generar la pérdida constitutiva o condicional de nocauts función sigue siendo de costos y mano de obra intensiva, así como mucho tiempo. Además de estos retos, la retina expresan los genes pueden tener un papel esencial fuera de la retina que conduce a confunde no deseados cuando se utiliza un enfoque de octavos de final. Además, la capacidad de expresar ectópica de un gen en una ganancia de experimento de la función puede ser muy valioso cuando se intenta identificar un papel en la especificación del destino celular y / o diferenciación terminal. Se presenta un método para la incorporación rápida y eficiente de los plásmidos de ADN en la retina del ratón neonatal mediante electroporación. La aplicación de impulsos eléctricos cortos por encima de una cierta fuerza los resultados de campo en un aumento transitorio de la permeabilidad de la membrana plasmática, lo que facilita la transferencia de material a través de la membrana 1,2,3,4. Trabajo pionero demuestra que la electroporación podría ser utilizado como un método de transferencia de genes en células de mamífero mediante la inducción de la formación de poros hidrofílicos de la membrana plasmática que permite el paso de ADN altamente cargadas a través de la bicapa lipídica 5. Continuo desarrollo técnico, ha dado como resultado la viabilidad de la electroporación como un método para la transferencia de genes in vivo en tejidos de ratón múltiples, incluyendo la retina, el método que se describe en este documento 6, 7, 8, 9, 10. Solución de ADN se inyecta en el espacio subretiniano para que el ADN se encuentra entre el epitelio retinal pigmentado y la retina del recién nacido (P0) del ratón y los impulsos eléctricos se aplican mediante un electrodo de pinza. La colocación lateral de los ojos en el ratón permite la fácil orientación del electrodo de la pinza es necesario alineación polo negativo de polo-DNA-retina-positivo. Incorporación extensiva y expresión de los genes transferidos pueden ser identificados por el día postnatal 2 (P2). Debido a la falta de una importante migración lateral de las células de la retina, las regiones y no electroporated electroporación, se generan. No electroporated regiones pueden servir como controles internos histológico en su caso. Electroporación de retina pueden ser utilizadas para expresar un gen bajo un promotor ubicuo, como CAG, o para alterar la función de genes usando construcciones ARNhc o la recombinasa Cre. La expresión más específica se puede lograr mediante el diseño de las construcciones con los promotores de genes específicos de células. La visualización de las células por electroporación se consigue mediante construcciones bicistrónico que expresan GFP o co-electroporating una expresión GFP construir. Además, múltiples construcciones puede ser electroporación para el estudio de los efectos de genes combinatoria o ganancia simultánea y pérdida de función de genes diferentes. Electroporación retina también puede ser utilizado para el análisis genómico de elementos reguladores cis-mediante la generación de construcciones apropiadas expresión y mutantes de deleción. Estos experimentos pueden ser utilizados para identificar regiones reguladoras cis-suficientes o necesarios para la expresión genética en células específicas 11. Experimentos potenciales sólo están limitadas por la disponibilidad de la construcción.

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In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Un método para la incorporación de ADN plásmido en murino células de la retina con el propósito de llevar a cabo ya sea ganancia o pérdida de los estudios de función<em&gt; In vivo</em&gt; Se presenta. Este método aprovecha el aumento transitorio de la permeabilidad de las membranas plasmáticas de células inducida por la aplicación de un campo eléctrico externo.

En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

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Neuroscience

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

20.7K vistas.  Johns Hopkins School of Medicine. Un método para la incorporación de ADN plásmido en murino células de la retina con el propósito de llevar a cabo ya sea ganancia o pérdida de los estudios de función In vivo Se presenta. Este método aprovecha el aumento transitorio de la permeabilidad de las membranas plasmáticas de células inducida por la aplicación de un campo eléctrico externo.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Investigación

Neurociencias

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

La cuantificación de la actividad de Cis Elementos reguladores en la retina del ratón por electroporación explante

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Transferencia de genes a la oreja del ratón en desarrollo por el interior<em&gt; En Vivo</em&gt; La electroporación

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Ex cultivo in vivo de la Plenaria, los cerebros en desarrollo de Drosophila

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...