Esta metodologia fornece uma abordagem de perda de função para estudos do desenvolvimento da retina em pintinhos. Esta técnica suporta a supressão rápida e persistente de genes-alvo em uma área específica da retina. Esta abordagem também pode ser aplicada a outras partes do embrião de pintinho, incluindo os tecidos neurais e não neurais.
Para eletroporação in ovo, prepare uma solução 0,25%Fast Green dissolvendo 25 miligramas de Fast Green FCF em 10 mililitros de PBS e, em seguida, filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,2 mícron. Em seguida, prepare a solução de injeção de coquetel de DNA misturando o plasmídeo de GFP esmeralda de microRNA com o plasmídeo de expressão da transposase Tol2 em uma proporção de dois para um. Em seguida, adicione a solução Fast Green preparada ao coquetel de DNA na proporção de um para 10 para visualização da área injetada.
Em seguida, configure o aparelho de microinjeção. O aparelho consiste em uma seringa de Hamilton, uma agulha de duas polegadas de calibre 18, um tubo de cloreto de polivinila de dois centímetros de comprimento e uma agulha de micropipeta. Encha a seringa de Hamilton com óleo mineral pesado, em seguida, prenda a agulha de calibre 18 à seringa e preencha o espaço interno da agulha com óleo, pressionando o êmbolo da seringa.
Em seguida, prenda o tubo de cloreto de polivinila na extremidade da agulha e encha o tubo com o óleo. Conecte a agulha de micropipeta puxada à tubulação. Em seguida, sob o microscópio dissecante usando pinças finas, quebre a ponta da agulha para um diâmetro de 10 a 20 micrômetros para fazer uma pequena abertura.
Encha toda a agulha com óleo. Em seguida, coloque cinco microlitros do coquetel de DNA colorido em uma placa de Petri. Sob o microscópio dissecante, coloque a ponta da agulha de micropipeta na solução de DNA na placa de Petri e lentamente puxe a solução para dentro da agulha.
Depois que a pressão tiver se equilibrado dentro e fora da agulha, retire a ponta da agulha da solução de DNA e mantenha-a submersa em PBS estéril em um copo pequeno até a injeção. Em seguida, para montar o aparelho de eletroporação, ajuste um par de eletrodos de platina firmemente com um suporte de eletrodos em um micromanipulador. Ajuste o espaçamento entre a ponta dos eletrodos para dois milímetros e conecte os eletrodos a um gerador de pulsos de onda quadrada com cabos.
Em seguida, para a microinjeção de DNA, remova um ovo fertilizado de White Leghorn da incubadora e limpe a superfície do ovo com papel de seda embebido em etanol 70%. Em seguida, prenda uma agulha calibre 18 a uma seringa de 10 mililitros e insira a agulha através da extremidade romba do ovo, inclinada para baixo para evitar danificar a gema. Depois de retirar dois a três mililitros de albumina do ovo, sele o orifício com um pedaço de fita adesiva e vele o ovo com luz para garantir que o embrião e a membrana vitelínica estejam desprendidos da casca.
Em seguida, usando pinças, retire um pedaço de casca do ovo da parte superior do ovo, expondo o embrião. Não retire mais de cinco ovos ao mesmo tempo para evitar a secagem dos embriões durante a eletroporação. Insira a ponta da agulha na vesícula óptica a partir de seu lado proximal em um ângulo de 45 graus e injete o coquetel de DNA pressionando lentamente o êmbolo até que a solução de cor azul preencha o lúmen.
Retire a agulha e coloque sua ponta de volta no PBS. Para eletroporação, ajuste a tensão de pulso para 15 volts, o comprimento do pulso para 15 milissegundos, o intervalo de pulso para 915 milissegundos e o número de pulso para cinco. Depois de adicionar algumas gotas de HBSS na membrana vitelínica sobre o embrião, use o micromanipulador para baixar os eletrodos no HBSS perpendicularmente ao eixo anteroposterior do embrião.
Coloque os eletrodos em ambos os lados da vesícula óptica, garantindo que os eletrodos não toquem o embrião ou os vasos sanguíneos, em seguida, aplique campos elétricos pulsados. Após a eletroporação estar completa, remova os eletrodos e limpe suavemente os eletrodos com um cotonete estéril embebido em água para evitar o acúmulo de albumina. Sele a janela com fita adesiva e reincube o embrião até o estágio de desenvolvimento desejado.
A transfecção de sequências individuais de pré-microRNA em Nel AP expressando células HEK293T resultou em supressão significativa da expressão de Nel por construções contra os nucleotídeos 482 a 502, 910 a 930 e 2461 a 2481. O encadeamento de duas sequências de microRNA aumentou significativamente a eficiência do knockdown. Todas as três combinações mostraram atividades de supressão aumentadas em comparação com sequências individuais de pré-microRNA desencadeadas.
Supressão robusta foi observada pelo menos 13 dias após a transfecção. Quando uma construção de pré-microRNA de Nel visando os nucleotídeos 482 a 502 e 2461 a 2481 foi co-transfectada com o vetor de expressão de transposase para a retina de pintinhos, a expressão de Nel no epitélio pigmentar da retina foi significativamente reduzida em células de GFP esmeralda expressando células no dia embrionário 4.5. Em embriões de oito dias de idade, a expressão de Nel também diminuiu nas células ganglionares da retina.
Em contraste, a expressão de Nel na retina não foi afetada pela introdução do microRNA controle. Após esse procedimento, os efeitos sobre a supressão do gene alvo podem ser examinados usando vários métodos, como exames de proliferação e diferenciação celular, morte celular e rastreamento celular e axonal.
