私の研究室ではCOVID-19の研究に取り組んでおり、最近ではSARS-CoV-2抗体を迅速かつ正確に検出できる新しいアッセイを開発しました。このプロトコルは、現在のパンデミックを考えると重要である患者血清サンプル中の抗SARS-CoV-2抗体を検出するための高スループットアッセイを概説する。現在の血清学的アッセイの大部分は、感度の速度を犠牲にしたり、その逆を行ったりします。
私たちのデータは、アッセイが敏感であり、迅速な応答時間を持っていることを示しています。十分な量の高いHiBiT-RBDバイオレポーターを製造するために、細胞培養の準備から始める。まず、10%のウシ胎児血清と1%ペニシリンとストレプトマイシンを含む完全なDulbeccoの改変ワシ培地を調製する。
その後、37°Cの水浴でメディアを温めます。生物学的安全キャビネットをオンにし、キャビネット表面を殺菌するために70%エタノールを使用してください。細胞株を培養するには、マイナス80度または液体窒素から取り出し、37度の水浴で解凍します。
解凍した細胞を完全な培地の少なくとも10ミリリットルと混合する。細胞懸濁液を15センチメートルのペトリ皿にピペットし、プレートを旋回して細胞を均一に分配する。37°C、5%の二酸化炭素、および85〜95%の湿度で細胞培養インキュベーターに皿を置きます。
合流レベルが80〜90%に達するまで顕微鏡下で細胞を観察し、高い合流度で培地を取り除き、温かいPBSで細胞を洗い、0.25%トリプシンEDTAの3〜5ミリリットルを加えて細胞を表面から取り外します。約5分後、顕微鏡で細胞を見てください。すべての細胞が浮遊している場合は、少なくとも4ミリリットルの培地を加え、細胞懸濁液を新しい滅菌チューブに移します。
ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、トランスフェクションのために6ウェルプレートの各ウェルに100万個の細胞を追加します。HiBiT-RBDプラスミドのトランスフェクションを行う場合は、適切なトランスフェクション試薬を用いて、1マイクログラムのHiBiT-RBD発現プラスミドを使用してください。室温で10〜15分間インキュベートし、プレートの各ウェルに合計体積を滴下します。
翌日、トランスフェクション混合物を含む培地を完全な培地に交換します。トランスフェクション後48時間でトランスフェクションコントロールをよく観察します。1.5ミリリットルマイクロチューブで上清を収集します。
1X受動リシスバッファーまたは PLB の 500 マイクロリットルを細胞に加え、細胞のリシスのために室温でプレートを 15 分間インキュベートして振ります。次に、ルシファーゼアッセイを用いて生体レポーターからの発光シグナルを評価し、まず、反応成分を調製し、その上清をバイオレポーターの供給源として使用する。大きなBiTと基板を使用前に1倍に希釈してください。
各ウェルまたはチューブから上澄み液の50マイクロリットルを96ウェルプレートに移し、1X大BiTの50マイクロリットルを各ウェルに加えます。室温で5分間インキュベートします。ルミノメーターソフトウェアを開き、各ウェルに1X基板の50マイクロリットルを追加し、照明計にプレートを配置し、ソフトウェアを実行します。
HiBiT-RBD抗体検出アッセイを実行するために、前述のようにHiBiT-RBDバイオレポーターを調製し、上澄み物を含むHiBiT-RBDの50マイクロリットルを1.5ミリリットルマイクロチューブで市販SARS-CoV-2 RBD抗体の1マイクログラムと組み合わせます。20マイクロリットルの免疫グロブリン結合タンパク質またはプロテインGを溶液に加えます。PBSを加えて、総容積を300マイクロリットルにする。
チューブシェーカーまたはローテーター上のチューブを30分間インキュベートします。遠心分離機は12,000Gで30秒間。その後、上清を捨て、PBSで洗います。
このプロセスを3回繰り返して、無料のHiBiT-RBDを削除します。細胞をPBSの50マイクロリットルで再懸濁し、96ウェルプレートに移します。1X大BiTの50マイクロリットルを加え、5分間待ちます。
その後、1X NanoLuc基板の50マイクロリットルを加えます。すぐにルミネッセンス信号をルミノメーターで読み取ります。ハイスループットアッセイのためにHiBiT-RBDバイオレポーターを大量に準備し、各サンプルの96ウェルプレートの各ウェルに20マイクロリットルの磁気プロテインGとHiBiT-RBD上清の50マイクロリットルを組み合わせます。
各ウェルに血清サンプル10マイクロリットルを加え、PBSを加えて合計体積を150マイクロリットルにします。室温でシェーカーで30分間インキュベートします。次に、プレートを磁気ワッシャーの上に置き、プロテインG抗体複合体を沈殿させます。
各ウェルの中央部に溶液を捨て、洗浄用のPBSを加えます。過剰なHiBiT-RBDを除去するために、洗浄工程を少なくとも3回繰り返します。1X PBSの50マイクロリットルと1X大BiTの50マイクロリットルを加え、室温で少なくとも5分間インキュベートします。
ルミノメーターソフトウェアを準備します。その後、50マイクロリットルの1X基板を加えます。マシンにプレートを置き、ソフトウェアを実行し、信号を記録します。
空のウェルからの血清サンプル、コントロールサンプル、バックグラウンド信号からの信号を比較します。細胞のライセートを含むHiBiT-RBDとトランスフェクト細胞の上清の両方からのシグナルを記録し、適切なタンパク質源を評価した。データは、両方の部分を組み合わせたときに強い信号に比べて低い背景を示しました。
プロテインGの添加は、抗体沈殿を助ける。このアッセイは、市販のSARS-CoV-2中和抗体からのシグナルをコントロールIgGと比較するために使用した。特異的抗体シグナルは堅牢で、対照抗体は発光バックグラウンドレベルに近かった。
組換えは、外因性RBDを発現するMタンパク質の51位に変異を有する腫瘍溶質性小胞炎ウイルスまたはVSVを減弱し、マウスにワクチンを接種するために使用した。ワクチン接種されたマウスから採取された血清は、コントロールVSVを注射されたマウスのシグナルと比較して、堅牢なシグナルを産生した。このプロトコルは患者血清サンプルのSARS-CoV-2抗体の検出に使用することができる。
タンパク質Gでのインキュベーション後の洗浄ステップは、バックグラウンドを減らすために重要です。また、信号損失を避けるために、できるだけ早く基板を追加することが重要です。いくつかの追加の最適化ステップにより、同じアッセイを使用して血液サンプルを分析することができ、患者の血液サンプル中の抗SARS-CoV-2抗体を決定する有効な方法となり得る。
