Mon laboratoire a travaillé dans la recherche sur la COVID-19 et nous avons récemment mis au point un nouveau test qui nous a permis de détecter rapidement et avec précision les anticorps anti-SRAS-CoV-2. Ce protocole décrit un test à haut débit pour détecter les anticorps anti-SARS-CoV-2 dans les échantillons de sérum des patients, ce qui est essentiel compte tenu de la pandémie actuelle. La majorité des tests sérologiques actuels sacrifient la vitesse pour la sensibilité ou vice versa.
Nos données montrent que notre test est à la fois sensible et a un temps de réponse rapide. Afin de produire une quantité suffisante de biorapporteur HiBiT-RBD élevé, commencez par vous préparer à la culture cellulaire. Tout d’abord, préparez le milieu d’aigle modifié complet de Dulbecco contenant 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline et de streptomycine.
Ensuite, réchauffez les médias dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Allumez l’armoire de sécurité biologique et utilisez de l’éthanol à 70 % pour stériliser la surface de l’armoire. Pour cultiver la lignée cellulaire, retirez-la de moins 80 degrés Celsius ou d’azote liquide et décongelez-la dans un bain-marie de 37 degrés Celsius.
Mélanger les cellules décongelées avec au moins 10 millilitres de milieu complet. Pipettez la suspension cellulaire dans une boîte de Petri de 15 centimètres et faites tourbillonner la plaque pour répartir les cellules uniformément. Placez le plat dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 85 à 95% d’humidité.
Observez les cellules au microscope jusqu’à ce que le niveau de confluence atteigne 80 à 90% À haute confluence, retirez le milieu, lavez les cellules avec du PBS chaud et ajoutez trois à cinq millilitres de 0,25% de trypsine-EDTA pour détacher les cellules de la surface. Après environ cinq minutes, regardez les cellules au microscope. Si toutes les cellules flottent, ajoutez au moins quatre millilitres de milieu et transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube stérile.
Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajoutez un million de cellules dans chaque puits d’une plaque de six puits pour la transfection. Pour effectuer la transfection du plasmide HiBiT-RBD, utilisez un microgramme du plasmide d’expression HiBiT-RBD avec un réactif de transfection approprié. Incuber pendant 10 à 15 minutes à température ambiante, puis ajouter le volume total à chaque puits de la plaque goutte à goutte.
Le lendemain, remplacer le milieu contenant le mélange de transfection par un milieu complet. Observez bien le contrôle de la transfection 48 heures après la transfection. Recueillir le surnageant dans des microtubes de 1,5 millilitre.
Ajouter 500 microlitres de tampon de lyse passive 1X ou PLB aux cellules, puis incuber et agiter la plaque pendant 15 minutes à température ambiante pour la lyse cellulaire. Ensuite, pour évaluer le signal de luminescence du bioreporter à l’aide d’un test de luciférase, préparez d’abord les composants de la réaction et utilisez le surnageant comme source du bioreporter. Diluer le grand BiT et le substrat à 1X avant utilisation.
Transférez 50 microlitres du surnageant de chaque puits ou tube vers une plaque de 96 puits et ajoutez 50 microlitres de 1X grand BiT à chaque puits. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Ouvrez le logiciel du luminomètre, ajoutez 50 microlitres de substrat 1X à chaque puits, placez la plaque dans le luminomètre et exécutez le logiciel.
Afin d’effectuer le test de détection d’anticorps HiBiT-RBD, préparez le bioreporter HiBiT-RBD comme décrit précédemment et combinez 50 microlitres du surnageant contenant du HiBiT-RBD avec un microgramme de l’anticorps commercial SARS-CoV-2 RBD dans un microtube de 1,5 millilitre. Ajouter 20 microlitres de protéine de liaison aux immunoglobulines ou de protéine G à la solution. Porter le volume total à 300 microlitres en ajoutant pbS.
Incuber les tubes sur un agitateur à tube ou un rotateur pendant 30 minutes. Centrifuger à 12 000 G pendant 30 secondes. Ensuite, jetez le surnageant et lavez-le avec du PBS.
Répétez le processus trois fois pour supprimer HiBiT-RBD libre. Remettez en suspension les cellules dans 50 microlitres de PBS et transférez-les sur une plaque de 96 puits. Ajoutez 50 microlitres de 1X grand BiT et attendez cinq minutes.
Ajoutez ensuite 50 microlitres de substrat 1X NanoLuc. Lisez immédiatement le signal de luminescence avec un luminomètre. Préparer de plus grandes quantités du biorapporteur HiBiT-RBD pour un essai à haut débit et combiner 20 microlitres de protéine G magnétique avec 50 microlitres du surnageant HiBiT-RBD dans chaque puits d’une plaque de 96 puits pour chaque échantillon.
Ajouter 10 microlitres de l’échantillon de sérum à chaque puits et porter le volume total à 150 microlitres en ajoutant du PBS. Incuber pendant 30 minutes sur un agitateur à température ambiante. Ensuite, placez la plaque sur une rondelle magnétique pour précipiter le complexe d’anticorps de la protéine G.
Jetez la solution dans la section centrale de chaque puits et ajoutez PBS pour le lavage. Répétez l’étape de lavage au moins trois fois pour éliminer l’excès de HiBiT-RBD. Ajouter 50 microlitres de 1X PBS et 50 microlitres de 1X grand BiT et incuber pendant au moins cinq minutes à température ambiante.
Préparez le logiciel du luminomètre. Ajoutez ensuite 50 microlitres de substrat 1X. Placez la plaque dans la machine, exécutez le logiciel et enregistrez les signaux.
Comparez les signaux des échantillons de sérum, des échantillons de contrôle et du signal de fond des puits vides. Les signaux provenant à la fois du lysat cellulaire contenant du HiBiT-RBD et du surnageant des cellules transfectées ont été enregistrés pour évaluer la source de protéines appropriée. Les données ont montré un arrière-plan faible par rapport à un signal fort lorsque les deux parties ont été combinées.
L’ajout de protéine G aide à la précipitation des anticorps. Le test a été utilisé pour comparer le signal d’un anticorps neutralisant commercial du SRAS-CoV-2 avec une IgG témoin. Le signal d’anticorps spécifique était robuste, tandis que l’anticorps témoin avait un niveau proche du niveau de fond luminescent.
Le virus de la stomatite vésiculeuse vésiculeuse atténuée recombinante ou VSV avec une mutation à la position 51 de la protéine M exprimant la RBD exogène a été utilisé pour vacciner des souris. Le sérum prélevé sur des souris vaccinées a produit un signal robuste par rapport à aucun signal chez les souris injectées avec VSV témoin. Ce protocole peut être utilisé pour la détection des anticorps anti-SARS-CoV-2 dans des échantillons de sérum de patients.
Les étapes de lavage après l’incubation avec la protéine G sont essentielles pour réduire le fond. De plus, il est important d’ajouter le substrat le plus rapidement possible pour éviter la perte de signal. Avec quelques étapes d’optimisation supplémentaires, le même test peut être utilisé pour analyser des échantillons de sang et pourrait être une méthode efficace pour déterminer les anticorps anti-SARS-CoV-2 dans les échantillons de sang de patients.
