Este método nos permite caracterizar qué fármacos quimioterápicos son hidrolizados por SAMHD1 y puede utilizarse como ensayo de cribado para identificar inhibidores de moléculas pequeñas de esta enzima. La principal ventaja de esta técnica es que es simple, económica y proporciona una gran cantidad de información sobre cómo interactúan las diferentes moléculas pequeñas con esta enzima. La comprobante del procedimiento será Miriam, postdoc del grupo.
Para comenzar, prepare el tampón de reacción SAMHD1 completo agregando Tween-20 y TCEP a las concentraciones finales de 0.005% y 0.3 milimolares respectivamente. Prepare la solución de parada de EDTA añadiendo EDTA a una concentración final de 7,9 milimolares en tampón de reacción SAMHD1 completo. Prepare la solución de trabajo verde de malaquita o MG mezclando 10 partes de solución madre de MG con 2,5 partes de molibdato de amonio al 7% y 0,2 partes de Tween-20 al 11%.
Utilizando una pipeta multicanal, diluya en serie los compuestos de ensayo en el disolvente correspondiente a 100 veces la concentración final en una placa de polipropileno de 96 pocillos de fondo redondo transparente. diluya aún más estos compuestos a 25 veces la concentración final con un tampón de reacción SAMHD1 completo para mantener la concentración final de disolvente por debajo del 1 %Transfiera cinco microlitros de componente diluido a los pocillos apropiados de una placa de ensayo transparente de fondo plano de 384 pocillos y repita el procedimiento con muestras de control solo con disolvente. Para la preparación de la mezcla maestra de enzimas, diluya la proteína SAMHD1 humana recombinante y la pirofosfatasa recombinante en un tampón de reacción SAMHD1 completo hasta cuatro veces la concentración final deseada.
Prepare el activador o sustrato dGTP diluyendo la solución en tampón de reacción SAMHD1 completo para alcanzar una concentración de 50 micromolares. A los pocillos que contienen diluciones compuestas y control de solvente solamente, dispense cinco microlitros de mezcla maestra de pirofosfatasa SAMHD1, y a los pocillos de control sin enzimas, agregue cinco microlitros de tampón de reacción SAMHD1 completo. A continuación, dispense 10 microlitros de solución dGDP en todos los pocillos para iniciar la reacción e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Para detener la reacción, agregue 20 microlitros de solución de parada de EDTA. Después de agregar 10 microlitros de solución de trabajo MG a todos los pocillos, mezcle el contenido con un agitador de placas orbital de micropocillos y centrifugue la placa a 1000 x g durante un minuto. Incubar la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente y leer la absorción a 630 nanómetros en un lector de placas de micropocillos.
Calcule la desviación estándar de los pozos de control positivo y luego calcule el promedio. De manera similar, para los pozos de control negativos, calcule la desviación estándar y luego calcule el promedio. Calcular el factor Z es un indicador de la calidad del ensayo.
Normalice cada valor de absorbancia a los valores medios de los controles positivos y negativos. Establecer el control positivo como 100% de actividad SAMHD1 y el control negativo como 0% de actividad SAMHD1. La actividad de SAMHD1 es una función de la concentración del compuesto y se ajusta a una curva de dosis-respuesta de pendiente variable de cuatro parámetros, lo que permite determinar la concentración inhibitoria máxima media del compuesto.
Diluya las existencias de análogos de nucleótidos y complete el tampón de reacción SAMHD1 a cuatro veces la concentración final y transfiera cinco microlitros a los pocillos apropiados de una placa de ensayo de 384 pocillos. Para preparar la enzima SAMHD1 o la mezcla maestra de pirofosfatasa, diluya la proteína SAMHD1 humana recombinante y la pirofosfatasa de Escherichia coli en un tampón de reacción SAMHD1 completo hasta el doble de la concentración final deseada. Prepare solo la solución de pirofosfatasa diluyendo la pirofosfatasa recombinante de Escherichia coli al doble de la concentración final deseada en tampón de reacción SAMHD1 completo.
Del mismo modo, prepare los activadores GTP y dGTP alfa S diluyendo el stock en tampón de reacción SAMHD1 completo hasta cuatro veces la concentración final. Dispense cinco microlitros del activador, ya sea GDP o dGTP alfa S o tampón de reacción SAMHD1 completo a los pocillos apropiados de una placa de ensayo de 384 pocillos que contenga los análogos de nucleótidos. Inicie la reacción dispensando 10 microlitros de la mezcla maestra de pirofosfatasa SAMHD1, pirofosfatasa sola o tampón de reacción SAMHD1 completo en los pocillos apropiados e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Después de detener la reacción con una solución de parada de EDTA, agregue 10 microlitros de solución de trabajo MG a todos los pocillos. Una vez mezclado el contenido, centrifugar la placa a 1000 x g durante un minuto e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, mida la absorbancia a 630 nanómetros.
Calcule los valores medios de absorbancia para los pocillos de reacción de la pirofosfatasa solamente, que será el valor de fondo. A continuación, reste el valor de fondo de los pocillos correspondientes en las reacciones SAMHD1 o pirofosfatasa. Por último, grafique los valores de absorbancia corregidos para cada análogo de nucleótido con las condiciones de tampón GTP y dGTP alfa S.
En el presente estudio, el absorbente aumentó con el aumento de la concentración de fosfato de sodio después de la incubación con el reactivo verde de malaquita y alcanzó la saturación a una concentración de 0,25 milimolares. El rango de detección lineal de fosfato es visible de 0,004 a 0,03 milimolares. Se ilustra el requisito de los componentes del ensayo para lograr una actividad medible de SAMHD1.
Ni la SAMHD1 ni la pirofosfatasa por sí solas podrían generar un fosfato orgánico en presencia de dGTP. Sin embargo, cuando todos los componentes del ensayo estaban presentes, se observó un aumento en la señal. Las curvas de dosis-respuesta obtenidas para los compuestos inhibidores de SAMHD1 mostraron que el aumento de las concentraciones inhibe eficazmente la actividad de SAMHD1.
La hidroxiurea no inhibe la actividad de SAMHD1 in vitro, lo que fue indicado por la actividad de SAMHD1 no afectada con dosis crecientes de hidroxiurea. La unión de dGTP a ambos sitios alostéricos activa SAMHD1, lo que permite la hidrólisis posterior de este nucleótido, mientras que los otros tres dNTP canónicos requieren primero la activación de GTP del primer sitio alostérico antes de que puedan unirse al segundo sitio alostérico y luego hidrolizarse en el sitio catalítico. Para los análogos de nucleótidos, el trifosfato de clofarabina es un activador del sitio alostérico dos y un sustrato, ya que se observa actividad en presencia de GTP.
Mientras que el trifosfato de citarabina solo puede ocupar el sitio catalítico, ya que se requiere dGTP alfa S para observar la actividad. No se observó actividad con el trifosfato de gemcitabina. Tras la identificación de pequeñas moléculas que inhiben SAMHD1 en este ensayo, se pueden utilizar enfoques físicos, como los ensayos de desplazamiento térmico, para interrogar el compromiso del objetivo.
El método aquí mostrado nos ayudó a comprender cuál de los fármacos contra el cáncer puede ser hidrolizado por SAMHD1 y establecer esta enzima como una posible diana terapéutica para superar la resistencia a los fármacos.
