Este método permite caracterizar quais drogas quimioterápicas são hidrolisadas por SAMHD1 e pode ser usado como um ensaio de triagem para identificar pequenas moléculas inibidoras dessa enzima. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, barata e produz uma vasta quantidade de informações sobre como diferentes pequenas moléculas interagem com essa enzima. Quem demonstrará o procedimento será Miriam, pós-doutoranda do grupo.
Para começar, prepare o tampão de reação SAMHD1 completo adicionando Tween-20 e TCEP às concentrações finais de 0,005% e 0,3 milimolar, respectivamente. Preparar a solução de parada de EDTA adicionando EDTA a uma concentração final de 7,9 milimolares em tampão de reação SAMHD1 completo. Prepare a solução de trabalho verde de malaquita ou MG misturando 10 partes da solução-mãe MG com 2,5 partes de molibdato de amónio a 7% e 0,2 partes de Tween-20 a 11%.
Usando uma pipeta multicanal, diluir em série os compostos de teste no solvente relevante a 100 vezes a concentração final em uma placa redonda clara de polipropileno de 96 poços. diluir ainda mais estes compostos até 25 vezes a concentração final com tampão de reacção SAMHD1 completo para manter a concentração final do solvente abaixo de 1%Transfira cinco microlitros de componente diluído para os poços apropriados de uma placa de ensaio de fundo plano transparente de 384 poços e repita o procedimento com amostras de controlo apenas com solvente. Para a preparação da mistura mestre enzimática, diluir a proteína SAMHD1 humana recombinante e a pirofosfatase recombinante em tampão de reação SAMHD1 completo até quatro vezes a concentração final desejada.
Preparar o ativador ou substrato dGTP diluindo a solução em tampão de reação SAMHD1 completo para atingir a concentração de 50 micromolares. Para os poços contendo diluições de compostos e controle somente de solvente, dispensar cinco microlitros de mistura mestre de pirofosfatase SAMHD1 e, para os poços de controle sem enzima, adicionar cinco microlitros de tampão de reação SAMHD1 completo. Em seguida, distribua 10 microlitros de solução dGDP em todos os poços para iniciar a reação e incube por 20 minutos à temperatura ambiente.
Para parar a reação, adicione 20 microlitros de solução parada EDTA. Depois de adicionar 10 microlitros de solução de trabalho MG a todos os poços, misture o conteúdo usando um agitador de placa de micropoço orbital e centrifugue a placa a 1000 x g por um minuto. Incubar a placa por 20 minutos à temperatura ambiente e ler a absorção a 630 nanômetros em um leitor de placa de micropoço.
Calcular o desvio padrão dos poços de controle positivo e, em seguida, calcular a média. Da mesma forma para os poços de controle negativo, calcule o desvio padrão e, em seguida, calcule a média. Calcular o fator Z é um indicador da qualidade do ensaio.
Normalizar cada valor de absorbância para os valores médios dos controles positivo e negativo. Definir o controle positivo como 100%SAMHD1 atividade e o controle negativo como 0%SAMHD1 atividade. A atividade do gráfico SAMHD1 é função da concentração do composto e ajusta-se a uma curva de resposta de dose variável de inclinação de quatro parâmetros, permitindo a determinação da metade da concentração inibitória máxima do composto.
Diluir os estoques análogos de nucleotídeos e completar o tampão de reação SAMHD1 até quatro vezes a concentração final e transferir cinco microlitros para os poços apropriados de uma placa de ensaio de 384 poços. Para preparar a mistura mestre da enzima SAMHD1 ou pirofosfatase, diluir a proteína SAMHD1 humana recombinante e a pirofosfatase de Escherichia coli em tampão de reação SAMHD1 completo até o dobro da concentração final desejada. Preparar apenas a solução de pirofosfatase diluindo a pirofosfatase recombinante de Escherichia coli até ao dobro da concentração final desejada em tampão de reacção SAMHD1 completo.
Da mesma forma, prepare os ativadores GTP e dGTP alfa S diluindo o estoque em tampão de reação SAMHD1 completo para quatro vezes a concentração final. Distribuir cinco microlitros do ativador, GDP ou dGTP alfa S ou tampão de reação SAMHD1 completo nos poços apropriados de uma placa de ensaio de 384 poços contendo os análogos de nucleotídeos. Inicie a reação dispensando 10 microlitros de mistura mestre de pirofosfatase SAMHD1, pirofosfatase isolada ou tampão de reação SAMHD1 completo nos poços apropriados e incube por 20 minutos à temperatura ambiente.
Depois de parar a reação usando solução de parada EDTA, adicione 10 microlitros de solução de trabalho MG a todos os poços. Uma vez misturado o conteúdo, centrifugar a placa a 1000 x g durante um minuto e incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, meça a absorbância em 630 nanômetros.
Calcule os valores médios de absorbância para os poços de reação somente pirofosfatase, que será o valor de fundo. Em seguida, subtraia o valor de fundo dos poços correspondentes nas reações SAMHD1 ou pirofosfatase. Finalmente, plotar os valores de absorbância corrigidos para cada análogo de nucleotídeo com as condições de tampão GTP e dGTP alfa S.
No presente estudo, o absorvente aumentou com o aumento da concentração de fosfato de sódio após incubação com o reagente verde de malaquita e atingiu a saturação na concentração de 0,25 milimolar. A faixa de detecção linear de fosfato é visível de 0,004 a 0,03 milimolar. A exigência de componentes de ensaio para alcançar a atividade SAMHD1 mensurável é ilustrada.
Nem SAMHD1 nem pirofosfatase isoladamente foram capazes de gerar fosfato orgânico na presença de dGTP. No entanto, quando todos os componentes do ensaio estavam presentes, observou-se aumento do sinal. As curvas de dose-resposta obtidas para os compostos inibidores de SAMHD1 mostraram que concentrações crescentes inibem efetivamente a atividade de SAMHD1.
A hidroxiureia não inibe a atividade de SAMHD1 in vitro, o que foi indicado pela atividade de SAMHD1 não afetada com doses crescentes de hidroxiureia. A ligação do dGTP a ambos os sítios alostéricos ativa SAMHD1, permitindo a hidrólise subsequente deste nucleotídeo, enquanto os outros três dNTPs canônicos primeiro requerem a ativação do GTP do primeiro sítio alostérico antes que possam se ligar ao segundo sítio alostérico e, em seguida, serem hidrolisados no sítio catalítico. Para análogos de nucleotídeos, o trifosfato de clofarabina é um ativador do sítio alostérico dois e um substrato à medida que a atividade é observada na presença de GTP.
Considerando que o trifosfato de citarabina só é capaz de ocupar o sítio catalítico como dGTP alfa S é necessário para observar a atividade. Nenhuma atividade foi observada com o trifosfato de gemcitabina (gencitabina). Após a identificação de pequenas moléculas inibindo SAMHD1 neste ensaio por abordagens físicas, tais como ensaios de deslocamento térmico, pode ser usado para interrogar o engajamento do alvo.
O método aqui mostrado nos ajudou a entender quais das drogas contra o câncer podem ser hidrolisadas por SAMHD1 e estabelecer essa enzima como um potencial alvo terapêutico para superar a resistência às drogas.
