Bu yöntem, hangi kemoterapi ilaçlarının SAMHD1 tarafından hidrolize edildiğini karakterize etmemizi sağlar ve bu enzimin küçük moleküllü inhibitörlerini tanımlamak için bir tarama testi olarak kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, basit, ucuz olması ve farklı küçük moleküllerin bu enzimle nasıl etkileşime girdiği hakkında çok miktarda bilgi vermesidir. Prosedürü gösteren, gruptan bir doktora sonrası olan Miriam olacaktır.
Başlamak için, sırasıyla% 0.005 ve 0.3 milimolar nihai konsantrasyonlara Tween-20 ve TCEP ekleyerek tam SAMHD1 reaksiyon tamponu hazırlayın. Tam SAMHD1 reaksiyon tamponunda 7.9 milimolar nihai konsantrasyona EDTA ekleyerek EDTA durdurma çözeltisini hazırlayın. 10 kısım MG stok çözeltisini 2.5 kısım %7 amonyum molibdat ve 0.2 kısım %11 Tween-20 ile karıştırarak malakit yeşili veya MG çalışma solüsyonu hazırlayın.
Çok kanallı bir pipet kullanarak, şeffaf yuvarlak tabanlı polipropilen 96 oyuklu bir plakada ilgili çözücü içinde test bileşiklerini nihai konsantrasyonun 100 katı oranında seri olarak seyreltin. Nihai çözücü konsantrasyonunu %1'in altında tutmak için bu bileşikleri tam SAMHD1 reaksiyon tamponu ile nihai konsantrasyonun 25 katına kadar seyreltin Beş mikrolitre seyreltilmiş bileşeni şeffaf 384 kuyulu düz tabanlı bir tahlil plakasının uygun kuyucuklarına aktarın ve prosedürü yalnızca çözücü kontrol numuneleri ile tekrarlayın. Enzim ana karışımı hazırlığı için, rekombinant insan SAMHD1 proteinini ve rekombinant pirofosfatazı tam SAMHD1 reaksiyon tamponunda istenen nihai konsantrasyonun dört katına kadar seyreltin.
50 mikromolar konsantrasyona ulaşmak için çözeltiyi tam SAMHD1 reaksiyon tamponunda seyrelterek aktivatör veya substrat dGTP'yi hazırlayın. Bileşik dilüsyonları ve sadece çözücü kontrolü içeren kuyucuklara, beş mikrolitre SAMHD1 pirofosfataz ana karışımı dağıtın ve enzim kontrol kuyularına beş mikrolitre tam SAMHD1 reaksiyon tamponu ekleyin. Daha sonra reaksiyonu başlatmak için tüm kuyucuklara 10 mikrolitre dGDP çözeltisi dağıtın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Reaksiyonu durdurmak için 20 mikrolitre EDTA durdurma çözeltisi ekleyin. Tüm kuyucuklara 10 mikrolitre MG çalışma solüsyonu ekledikten sonra, içeriği bir orbital mikrokuyu plaka çalkalayıcı kullanarak karıştırın ve plakayı bir dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin. Plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin ve bir mikrokuyu plaka okuyucusunda 630 nanometrede absorpsiyonu okuyun.
Pozitif kontrol kuyularının standart sapmasını hesaplayın ve ardından ortalamayı hesaplayın. Benzer şekilde, negatif kontrol kuyuları için standart sapmayı hesaplayın ve ardından ortalamayı hesaplayın. Z faktörünü hesaplamak, tahlil kalitesinin bir göstergesidir.
Her absorbans değerini pozitif ve negatif kontrollerin ortalama değerlerine normalleştirin. Pozitif kontrolün %100 SAMHD1 aktivitesi ve negatif kontrolün %0SAMHD1 aktivitesi olarak ayarlanması. Plot SAMHD1 aktivitesi, bileşik konsantrasyonunun bir fonksiyonudur ve bileşiğin yarı maksimal inhibitör konsantrasyonunun belirlenmesine izin veren dört parametreli değişken eğim doz yanıt eğrisine uyar.
Nükleotid analog stoklarını seyreltin ve SAMHD1 reaksiyon tamponunu nihai konsantrasyonun dört katına kadar tamamlayın ve beş mikrolitreyi 384 oyuklu bir tahlil plakasının uygun kuyucuklarına aktarın. Enzim SAMHD1 veya pirofosfataz ana karışımını hazırlamak için, rekombinant insan SAMHD1 proteinini ve Escherichia coli pirofosfatazı tam SAMHD1 reaksiyon tamponunda istenen nihai konsantrasyonun iki katına kadar seyreltin. Rekombinant Escherichia coli pirofosfatazı tam SAMHD1 reaksiyon tamponunda istenen nihai konsantrasyonun iki katına seyrelterek sadece pirofosfataz çözeltisi hazırlayın.
Benzer şekilde, stoğu tam SAMHD1 reaksiyon tamponunda nihai konsantrasyonun dört katına kadar seyrelterek aktivatörler GTP ve dGTP alpha S hazırlayın. Nükleotid analoglarını içeren 384 kuyulu bir tahlil plakasının uygun kuyucuklarına GDP veya dGTP alfa S veya tam SAMHD1 reaksiyon tamponu olmak üzere beş mikrolitre aktivatör dağıtın. 10 mikrolitre SAMHD1 pirofosfataz ana karışımı, tek başına pirofosfataz veya tam SAMHD1 reaksiyon tamponunu uygun kuyucuklara dağıtarak reaksiyonu başlatın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
EDTA durdurma çözeltisi kullanarak reaksiyonu durdurduktan sonra, tüm kuyucuklara 10 mikrolitre MG çalışma çözeltisi ekleyin. İçindekiler karıştırıldıktan sonra, plakayı 1000 x g'da bir dakika santrifüjleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Ardından absorbansı 630 nanometrede ölçün.
Pirofosfataz için ortalama absorbans değerlerini hesaplayın, sadece arka plan değeri olacak olan reaksiyon kuyuları. Ardından, arka plan değerini SAMHD1 veya pirofosfataz reaksiyonlarındaki karşılık gelen kuyucuklardan çıkarın. Son olarak, tampon GTP ve dGTP alfa S koşulları ile her bir nükleotid analoğu için düzeltilmiş absorbans değerlerini çizin.
Bu çalışmada, malakit yeşili reaktifi ile inkübasyonu takiben artan sodyum fosfat konsantrasyonu ile emici artmış ve 0.25 milimolar konsantrasyonda doygunluğa ulaşmıştır. Fosfatın doğrusal algılama aralığı 0.004 ila 0.03 milimolar arasında görülebilir. Ölçülebilir SAMHD1 aktivitesi elde etmek için tahlil bileşenlerinin gerekliliği gösterilmiştir.
Ne SAMHD1 ne de pirofosfataz tek başına dGTP varlığında organik bir fosfat üretemez. Bununla birlikte, tüm tahlil bileşenleri mevcut olduğunda, sinyalde bir artış gözlendi. SAMHD1 inhibitör bileşikleri için elde edilen doz yanıt eğrileri, artan konsantrasyonların SAMHD1 aktivitesini etkili bir şekilde inhibe ettiğini göstermiştir.
Hidroksiüre, artan hidroksiüre dozları ile etkilenmemiş SAMHD1 aktivitesi ile gösterilen in vitro SAMHD1 aktivitesini inhibe etmez. Her iki allosterik bölgeye dGTP bağlanması, SAMHD1'i aktive ederek bu nükleotidin müteakip hidrolizine izin verirken, diğer üç kanonik dNTP, ikinci allosterik bölgeyi bağlamadan ve daha sonra katalitik bölgede hidrolize edilmeden önce birinci allosterik bölgenin GTP aktivasyonunu gerektirir. Nükleotid analogları için, klofarabin trifosfat, GTP varlığında aktivite gözlendiği için bir allosterik bölge iki aktivatörü ve bir substrattır.
Sitarabin trifosfat ise aktiviteyi gözlemlemek için dGTP alfa S gerektiğinden yalnızca katalitik bölgeyi işgal edebilir. Gemsitabin trifosfat ile herhangi bir aktivite gözlenmedi. Bu tahlilde SAMHD1'i inhibe eden küçük moleküllerin termal kayma tahlilleri gibi fiziksel yaklaşımlarla tanımlanmasını takiben, hedef katılımını sorgulamak için kullanılabilir.
Burada gösterilen yöntem, hangi kanser ilaçlarının SAMHD1 tarafından hidrolize edilebileceğini anlamamıza ve bu enzimi ilaç direncinin üstesinden gelmek için potansiyel bir terapötik hedef olarak oluşturmamıza yardımcı oldu.
