该方法使我们能够表征哪些化疗药物被 SAMHD1 水解，并可用作筛选测定以鉴定该酶的小分子抑制剂。这种技术的主要优点是它简单、便宜，并且产生大量关于不同小分子如何与这种酶相互作用的信息。演示该程序的将是该小组的博士后Miriam。
首先，通过将吐温-20和TCEP分别加入0.005%和0.3毫摩尔的终浓度来制备完整的SAMHD1反应缓冲液。通过在完全SAMHD1反应缓冲液中加入终浓度为7.9毫摩尔的EDTA来制备EDTA终止溶液。将10份MG储备溶液与2.5份7%钼酸铵和0.2份11%吐温-20混合，制备孔雀石绿或MG工作溶液。
使用多通道移液器，在透明圆底聚丙烯 96 孔板中以最终浓度的 100 倍在相关溶剂中连续稀释测试化合物。用完整的SAMHD1反应缓冲液将这些化合物进一步稀释至终浓度的25倍，以将最终溶剂浓度保持在1%以下将5微升稀释的组分转移到透明的384孔平底测定板的适当孔中，并使用仅溶剂的对照样品重复该过程。对于酶预混液制备，将重组人SAMHD1蛋白和重组焦磷酸酶在完全SAMHD1反应缓冲液中稀释至所需终浓度的四倍。
通过在完全SAMHD1反应缓冲液中稀释溶液以达到50微摩尔浓度来制备活化剂或底物dGTP。向含有化合物稀释液和仅溶剂对照的孔中，分配5微升SAMHD1焦磷酸酶预混液，向无酶对照孔中加入5微升完全SAMHD1反应缓冲液。然后将 10 μL dGDP 溶液分配到所有孔中以开始反应并在室温下孵育 20 分钟。
要停止反应，加入20微升EDTA终止溶液。向所有孔中加入10微升MG工作溶液后，使用轨道微孔板振荡器混合内容物，并以1000×g离心板一分钟。将板在室温下孵育 20 分钟，并在微孔酶标仪中读取 630 纳米的吸收。
计算阳性对照井的标准偏差，然后计算平均值。同样，对于阴性对照井，计算标准偏差，然后计算平均值。计算Z因子是测定质量的指标。
将每个吸光度值归一化为阳性和阴性对照的平均值。将阳性对照设置为 100%SAMHD1 活性，将阴性对照设置为 0%SAMHD1 活性。绘制 SAMHD1 活性是化合物浓度的函数，并拟合四参数可变斜率剂量响应曲线，允许确定化合物的一半最大抑制浓度。
将核苷酸类似物储备液和完整的SAMHD1反应缓冲液稀释至终浓度的四倍，并将5微升转移到384孔测定板的适当孔中。为了制备酶SAMHD1或焦磷酸酶预混液，将重组人SAMHD1蛋白和大肠杆菌焦磷酸酶在完全SAMHD1反应缓冲液中稀释至所需终浓度的两倍。通过在完全SAMHD1反应缓冲液中将重组大肠杆菌焦磷酸酶稀释至所需终浓度的两倍，仅制备焦磷酸酶溶液。
类似地，通过将完全SAMHD1反应缓冲液中的储备液稀释至终浓度的四倍来制备活化剂GTP和dGTP α S。将 5 μL 活化剂（GDP 或 dGTP α S 或完全 SAMHD1 反应缓冲液）分配到含有核苷酸类似物的 384 孔测定板的适当孔中。通过将 10 μL SAMHD1 焦磷酸酶预混液、单独焦磷酸酶或完全 SAMHD1 反应缓冲液分配到适当的孔中并在室温下孵育 20 分钟来开始反应。
使用EDTA停止溶液停止反应后，向所有孔中加入10微升MG工作溶液。混合内容物后，将板以1000×g离心一分钟，并在室温下孵育20分钟。然后测量 630 纳米处的吸光度。
计算仅焦磷酸酶反应孔的平均吸光度值，这将是背景值。然后从SAMHD1或焦磷酸酶反应中的相应孔中减去背景值。最后，在缓冲液GTP和dGTP alpha S条件下绘制每个核苷酸类似物的校正吸光度值。
在本研究中，与孔雀石绿试剂孵育后，吸收剂随着磷酸钠浓度的增加而增加，并在0.25毫摩尔浓度时达到饱和。磷酸盐的线性检测范围为 0.004 至 0.03 毫摩尔。说明了测定组分实现可测量的 SAMHD1 活性的要求。
在dGTP存在下，SAMHD1和焦磷酸酶都不能单独产生有机磷酸盐。然而，当所有测定组分都存在时，观察到信号增加。SAMHD1抑制剂化合物的剂量反应曲线表明，增加浓度可有效抑制SAMHD1活性。
羟基脲在体外不抑制SAMHD1活性，这表现为随着羟基脲剂量的增加，SAMHD1活性不受影响。dGTP 与两个变构位点的结合激活 SAMHD1，允许随后水解该核苷酸，而其他三个经典 dNTP 首先需要 GTP 激活第一个变构位点，然后才能结合第二个变构位点，然后在催化位点水解。对于核苷酸类似物，三磷酸氯法拉滨是一种变构位点二激活剂和底物，因为在GTP存在下观察到活性。
而三磷酸阿糖胞苷只能占据催化位点，因为需要 dGTP α S 来观察活性。未观察到三磷酸吉西他滨的活性。在通过物理方法（例如热位移测定）鉴定该测定中抑制 SAMHD1 的小分子后，可用于询问靶标接合。
这里显示的方法帮助我们了解哪些抗癌药物可以被SAMHD1水解，并将这种酶确定为克服耐药性的潜在治疗靶点。
