Este protocolo permite evaluar in vitro el impacto del confinamiento y la rigidez media a la que están expuestos los megacariocitos nativos en la médula ósea sobre su comportamiento y maduración. La principal ventaja de esta técnica es un modelo simplificado que elimina las interacciones célula-célula y matriz celular y se centra en los aspectos mecánicos. Deben observarse estrictamente las buenas prácticas de laboratorio y las condiciones de trabajo estériles.
De hecho, incluso una ligera contaminación del hidrogel puede tener un impacto dramático en la diferenciación de megacariocitos. Para obtener un solo pozo de cultivo de células de hidrogel, comience descongelando dos alícuotas de un mililitro de metilcelulosa al 3% a temperatura ambiente, luego cubra una jeringa de bloqueo Luer de un mililitro con la metilcelulosa extrayendo primero un mililitro y luego expulsándola toda. A continuación, con la misma jeringa y aguja, extraiga 333 microlitros de metilcelulosa de una alícuota fresca.
Después de retirar cuidadosamente la aguja, use forzadores esterilizados para atornillar un conector de bloqueo Luer en el extremo de la jeringa, luego conecte una segunda jeringa de bloqueo Luer de un mililitro sin recubrimiento al conector. Distribuya por igual la metilcelulosa entre las dos jeringas y diséchelas a un lado. A continuación, resuspend las células madre y progenitoras hematopoyéticas negativas del linaje de ratón previamente aisladas en el medio de cultivo concentrado a una densidad de una vez 10 a las seis células por 167 microlitros.
Desconecte una de las jeringas del conector y pipetee 167 microlitros de la suspensión de la celda directamente en el conector mientras extrae simultáneamente el émbolo de la jeringa lentamente para dejar espacio para la suspensión de la celda. Después de agregar toda la suspensión de la celda en el conector, extraiga el émbolo para retirar la suspensión del conector y vuelva a conectar cuidadosamente la segunda jeringa, teniendo cuidado de no perder ninguna suspensión en la rosca del tornillo. Para homogeneizar el medio de metilcelulosa con la suspensión celular, mueva lentamente los émbolos hacia adelante y hacia atrás entre las dos jeringas 10 veces, luego extraiga el volumen total en una jeringa y desconecte las dos jeringas, dejando el conector en la vacía.
Vacíe el contenido de la jeringa en un pozo de una placa de cuatro pozos e incube la placa a 37 grados bajo 5% de dióxido de carbono. Para analizar los proplatlets, en el tercer día de cultivo, transfiera cuidadosamente todas las células de un pozo a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de DMEM con 1% PSG. Resuspend las células mediante pipeteo suave para diluir completamente la metilcelulosa, luego centrifugar el tubo durante cinco minutos a 300 veces G a temperatura ambiente.
Después de desechar el sobrenadante, vuelva a colocar el pellet celular en un mililitro de medio de cultivo completo y vuelva a sembrar las células a 500 microlitros por pozo de una placa de cuatro pozos. Incubar la placa a 37 grados centígrados bajo 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, utilizando un microscopio Brightfield con un objetivo 20X, adquiera aleatoriamente 10 imágenes por pozo, asegurándose de no tener demasiadas células en el campo de visión y capturando al menos cinco megacariocitos por campo.
Usando ImageJ, cuente el número total de megacariocitos y los que extienden proplatelets en cada imagen para calcular la proporción de megacariocitos que extienden proplatelets. Para fijar las células para futuros análisis, agregue la solución fijadora sobre la metilcelulosa sin interrumpir el gel. Después de esperar un tiempo apropiado dependiendo del fijador utilizado, use una pipeta P1000 para pipetear suavemente el fijador y el gel hasta que la metilcelulosa se haya diluido homogéneamente.
Y usando la misma punta de pipeta, transfiera todo el contenido del pozo a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de DPBS y homogeneice mezclando. Centrifugar la mezcla. Deseche el sobrenadante y resuspante el pellet de megacariocitos en un medio apropiado para el análisis deseado.
Para el tercer día de cultivo, los megacariocitos en el medio líquido se han sedimentado en el fondo del pozo y están en contacto con la superficie plástica rígida, así como con otras células. En contraste, las células incrustadas en el hidrogel de metilcelulosa están distribuidas homogéneamente y aisladas de las células vecinas. Un análisis del diámetro medio de los megacariocitos en diferentes condiciones de cultivo muestra que el 2% de metilcelulosa aumenta ligeramente el diámetro medio de los megacariocitos en comparación con el cultivo líquido.
Sin embargo, el aumento de la concentración de metilcelulosa en un 0,5% perjudica la diferenciación de megacariocitos como lo indica un diámetro medio más pequeño. En imágenes representativas de microscopía electrónica de transmisión, las membranas intracitoplasmáticas en los megacariocitos diferenciados in vivo dentro de la médula ósea parecen estar estrechamente opuestas con los territorios citoplasmáticos delineados. En cultivo líquido, las membranas tienen en su mayoría una pequeña apariencia ovalada redonda o vesículas alargadas sin delimitación de territorios citoplasmáticos.
Por el contrario, el cultivo de metilcelulosa al 2% tiene membranas estrechamente opuestas con territorios citoplasmáticos delimitadores que se asemejan a la estructura in situ. Para el cuarto día de cultivo, los megacariocitos previamente cultivados en hidrogel muestran una mayor formación de proplatlet en comparación con los cultivados en medio líquido. La proporción media de proplatados extensibles de megacariocitos suele ser de alrededor del 15 al 20% con un precultor líquido en comparación con el 35 al 40% con un precultor de hidrogel de metilcelulosa.
Al intentar este procedimiento, es importante pipetear los volúmenes apropiados con mucha precisión, ya que un cambio menor en la concentración final de metilcelulosa puede modificar significativamente la rigidez del medio. Después de la maduración celular en el hidrogel, los megacariocitos pueden ser recuperados para el análisis de ploidía y marcadores celulares por citometría de flujo o fijados para microscopía electrónica o inmunotinción de proteínas de interés.
