Este protocolo le ayuda a identificar las mutaciones que se producen durante la reparación de una rotura de doble cadena inducida por arn de guía única y CAS9. La principal ventaja de esta técnica es que es una forma rentable y robusta de detectar mutaciones en un locus genómico específico. Utilizamos el queratinocito humano como ejemplo, pero este protocolo se puede adaptar a cualquier línea celular transfectable.
Demostrando este protocolo estará Taylor Bugbee, un asistente de pregrado de nuestro laboratorio. Para comenzar, cultive células HFK LXSN y HFK 8E6 en placas de 10 centímetros a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono en una incubadora de camisa que contiene medios de cultivo de queratinocitos con suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos y estreptomicina de penicilina al 1%. Reemplace el medio de cultivo con tres mililitros de tripsina-EDTA e incube a 37 grados Celsius durante tres minutos.
Luego, neutralice la tripsina con un volumen igual de medios suplementados con FBS. Ahora, transfiera las células a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrífuga a 300 veces G durante cinco minutos. Vuelva a suspender las células con 10 mililitros de medios de cultivo de queratinocitos con suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos y determine la concentración de células con un hemocitómetro.
Después, sembra dos placas cada una para células HFK LXSN y HFK 8E6 en cuatro mililitros de medios de cultivo de queratinocitos con suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos y estreptomicina de penicilina al 1%. Después de la siembra, incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono en una incubadora de chaqueta. El día de la transfección, reemplace los medios con tres mililitros de medios suplementados sin antibióticos e incube durante dos horas a 37 grados centígrados en una incubadora de chaqueta.
Para transfectar las células, caliente los reactivos de transfección a temperatura ambiente y los pipete suavemente antes de usarlos. Coloque una cantidad adecuada de tampón de transfección en dos tubos de centrífuga estériles de 1,5 mililitros para cada línea celular y etiquételos como tubo uno y transfección simulada, o tubo dos. Luego, agregue dos microgramos de CD4 humano que expresa adn plásmido, CAS9, de guía única, dirigido a ARN para sondear uno y pipetear suavemente para mezclar por completo.
Agregue un volumen igual de agua estéril al tubo dos. Agregue una cantidad adecuada del reactivo de transfección al tubo uno con la mezcla de ADN y la transfección simulada o el tubo dos. Usando una pipeta, mézclelos suavemente por completo e incube a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos para formar los complejos.
Agregue la mezcla de transfección gota a gota a la placa y agite suavemente la placa de cultivo durante un minuto para distribuir uniformemente la mezcla de transfección. Para cosechar las células por tripsinización, reemplace los medios de cultivo con un mililitro de tripsina EDTA e incube a 37 grados Celsius durante tres minutos. Luego, neutralice la tripsina con un volumen igual de medios suplementados con FBS.
Para cada placa de células, transfiera la suspensión celular a dos tubos de microcentrífuga con alícuotas iguales y centrífuga a 300 veces G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet celular de un tubo en un mililitro de PBS para la secuenciación, y en otro tubo, con PBS helado para immunoblot. Se realizó un ensayo de immunoblot para comparar la expresión de CAS9 en células HFK no transfectadas y transectadas.
Los resultados muestran que las células HFK no transfectadas y transectadas expresaron una cantidad similar de CAS9, lo que indica que la eficiencia de transfección es similar entre dos líneas celulares. Se obtuvieron imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de histona fosforilada H2AX S139 en células transfectadas sgRNA/CAS9 y control no transfectado. Los resultados indicaron que dos roturas de doble cadena fueron inducidas por CAS9 SgRNA.
Las variaciones genómicas se agruparon por tipos de eventos mutacionales en HFK LXSN y HFK 8E6, donde se comparó cada grupo de variaciones genómicas y el número total de variaciones entre HFK LXSN y HFK 8E6. Los resultados mostraron que 8E6 aumenta las variaciones genómicas dentro de los 200 kilobases alrededor de las roturas de doble cadena inducidas por CAS9, lo que indica que el VPH 8E6 desregula la reparación de roturas de doble cadena y aumenta la inestabilidad genómica. El propósito de immunoblot es medir la eficiencia de la transfección, que debe considerarse durante el análisis de datos.
Además de la eficiencia de la transfección, la microscopía de inmunofluorescencia podría usarse para confirmar la inducción de rotura de doble cadena utilizando fosfo-H2AX como marcador. Usamos el vph beta 8E6 como ejemplo. Esta técnica se puede utilizar para detectar cambios en la frecuencia o el tipo de mutación causados por otros reactivos, como los inhibidores de moléculas pequeñas.
