Este protocolo proporciona un alto rendimiento y una composición confiable para el análisis de NHEJ que puede determinar la prevalencia y la cantidad relativa de mutaciones de Indel en poblaciones de mosquitos editados genéticamente. En comparación con la próxima generación, o secuenciación de Sanger, ddPCR tiene un tiempo de respuesta más rápido para los resultados, lo que permite un análisis rápido y completo de la variación genética en el campo para organismos genéticamente modificados. Este método debe ser generalmente aplicable a todos los sistemas experimentales.
La demostración del procedimiento será Thai Pham, un investigador asociado del personal del laboratorio de Yang. Para empezar, prepare 25 microlitros de la PCR de gota digital, o mezcla de muestras de ddPCR agregando súper mezcla de ddPCR, imprimaciones hacia adelante y hacia atrás, sondas HEX o FAM, ADN y agua en las proporciones descritas en el texto. Luego mezcle bien la reacción mediante vórtice.
Usando una pipeta multicanal de 50 microlitros, cargue 20 microlitros de la mezcla de muestras ddPCR en la fila central del cartucho. Luego use una pipeta multicanal de 200 microlitros para cargar 70 microlitros de aceite en la fila inferior sin generar burbujas en toda la pipeta. Coloque la junta, tocando solo los bordes, evitando el centro, el área cóncava, y luego coloque la placa de forma segura en el generador de gotas, y cierre la cubierta para iniciar la carrera.
Para transferir la mezcla de inmersión desde la fila superior del cartucho a la placa de 96 pocillos, use una pipeta multicanal y deje caer 40 microlitros de muestra líquida durante tres a cinco segundos en un ángulo de 30 a 45 grados. Luego expulse la mezcla en el pozo lentamente durante más de tres segundos en un ángulo de 45 grados, lo que permite que caiga desde un lado, y luego vaya a la segunda parada de la pipeta para expulsar el líquido por completo. Usando sellos térmicos de lámina, selle las placas durante cinco segundos a 180 grados centígrados.
Coloque la placa sellada en el termociclador y establezca las condiciones de PCR para las pautas de entrega de NHEJ estableciendo la desnaturalización inicial a 95 grados centígrados durante 10 minutos. Luego, establezca 40 ciclos de 94 grados celsius durante 30 segundos para desnaturalizarse, 55 grados celsius de un minuto a anneal y 60 grados celsius durante dos minutos para extenderse. Después de 40 ciclos, manténgalo a 98 grados centígrados durante 10 minutos y manténgalo final a cuatro grados centígrados.
Use una velocidad de rampa de dos grados centígrados por segundo para todos los pasos. La temperatura de recocido variará, según las sondas o imprimación utilizada. Coloque la placa de forma segura en el lector de gotas con el A1 bien etiquetado en la parte superior izquierda.
Abra el programa y configure la placa designando FAM como el canal de referencia conocido, y HEX como el desconocido para cada pozo. A continuación, cambie el nombre de cada muestra. Ejecute el experimento de lectura de gotas como cuantificación directa mientras guarda la plantilla.
Designe los parámetros experimentales correctos para el análisis de software, a saber, información de muestra, supermezcla, nombre de destino, tipo de objetivo, canal de señal uno y canal dos. Luego, establezca el umbral para el recuento de gotas por encima de 10, 000 para obtener resultados confiables. A continuación, verifique el recuento de gotas para cada pozo en la pestaña de gotas, asegurándose de que todos estén por encima de 10, 000.
Finalmente, verifique la amplitud 1D para una separación eficiente de la señal de los negativos. En el editor de placas, resalte toda la placa y configure el tipo de experimento para que se caiga. Establezca el objetivo WT como referencia, designando el canal uno para FAM y el canal dos para HEX.
Establezca el objetivo NHEJ como desconocido, designando el canal uno para FAM y el canal dos como ninguno. En la ficha Amplitud 2D, establezca los umbrales de clúster con las herramientas de gráfico para cada muestra. La cola normalmente se asocia con el grupo WT para los ensayos NHEJ.
En la pestaña de relación, haga clic en el icono de engranaje en la parte superior derecha del gráfico y seleccione la abundancia fraccional para trazar un punto correspondiente al porcentaje de eventos NHEJ. 15 muestras diferentes extraídas de 10 mosquitos cada una contenía varios alelos NHEJ, fueron analizadas e identificadas utilizando el ensayo de caída, y los resultados mostraron que las 15 muestras llevaban alelos 100% Indel. En otro experimento, se examinaron 11 muestras extraídas de mosquitos de tipo silvestre y mosquitos NHEJ con diferentes porcentajes de NHEJ con este protocolo ddPCR.
Los resultados mostraron que el porcentaje identificado fue comparativamente cercano a la técnica de análisis de detección por amplicon de Indel. Pipetear lentamente para evitar burbujas, y dejar que todas las gotas emulsionadas goteen por la pared de los pozos.
