Este protocolo describe un método que permite la identificación específica del sitio de residuos de cistina oxidada de proteínas. El método permite generar datos cuantitativos y específicos del sitio de residuos de cistina oxidada a partir de varios tipos de muestras. Para comenzar el procedimiento de captura asistida, lave los gránulos de proteína precipitada dos veces con acetona centrifugando a 20, 500 G, en cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
A continuación, decantar la acetona y retirar la acetona restante con una micropipeta. Usando una pipeta serológica de vidrio, agregue tres mililitros de acetona fresca helada al tubo y mezcle bien invirtiendo el tubo varias veces. Después del segundo lavado, deje que los gránulos se sequen al aire durante uno o dos minutos sin dejar que se sequen demasiado.
Agregue un mililitro de tampón B al pellet de proteína seca. Para solubilizar la proteína, sonicar el pellet repetidamente en un sonicador de baño con una salida de 250 vatios durante 15 a 30 segundos a la vez, junto con un breve vórtice. Realice el ensayo de ácido bicinchonínico o BCA para medir la concentración de proteína.
Para estandarizar las concentraciones de proteína, transfiera 500 microgramos de muestra de proteína a un filtro centrífugo de 0,5 mililitros y 10 kilodaltons, y aumente el volumen de la muestra a 500 microlitros con tampón de resuspensión. Centrifugar la mezcla tampón de proteínas a 14, 000 G a temperatura ambiente, hasta que el volumen en el filtro centrífugo sea inferior a 100 microlitros. Recoja la muestra invirtiendo el filtro en un tubo de recolección.
Centrifugar la muestra a 1000 G durante dos minutos y añadir tampón C para obtener un volumen final de 500 microlitros. Para reducir la proteína tioles, añadir 20 microlitros de 500 milimolares de ditiothreitol o DTT, a la muestra para obtener una concentración final de 20 milimolar, e incubar las muestras durante 30 minutos a 37 grados centígrados con agitación a 850 RPM. Después de la reducción, centrifugar a las muestras en filtros centrífugos de 0,5 mililitros y 10 kilodalton a 14, 000 G a temperatura ambiente, hasta que el volumen en el filtro centrífugo sea inferior a 100 microlitros.
Agregue el tampón D para completar el volumen a 500 microlitros y repita la centrifugación. Después de la cuarta centrifugación, recoger las muestras invirtiendo el filtro en un tubo de recogida para centrifugar a 1000 G durante dos minutos. Luego mida la concentración de proteína usando el ensayo BCA.
A continuación, coloque las columnas de centrifugado en un colector de vacío y, utilizando una micropipeta, transfiera 500 microlitros de la suspensión de resina de afinidad tiol recién preparada a cada columna. Aplicar vacío para la eliminación de agua. Repita el procedimiento una vez para obtener 30 miligramos de resina por columna.
Lave la resina cinco veces con 500 microlitros de agua ultrapura, aplicando un vacío para eliminar el agua y luego cinco veces con 500 microlitros de tampón E.In un nuevo tubo, agregue tampón C a 150 microgramos de la muestra de proteína reducida hasta que el volumen final sea de 120 microlitros. Transfiera la solución de proteína a una columna de centrifugado tapada que contenga la resina. Coloque la tapa en la columna e incube durante dos horas a temperatura ambiente agitando a 850 rpm.
Lave la resina como se describe en el manuscrito. Vuelva a colocar el enchufe. Para realizar la digestión tríptica sobre resina, agregue 120 microlitros de solución de tripsina recién preparada a las muestras e incube la columna durante la noche a 37 grados centígrados, con agitación a 850 RPM.
Al día siguiente, lave la resina varias veces como se describe en el manuscrito y reemplace el tapón. Usando una micropipeta, agregue 40 microlitros de tampón de bicarbonato de trietilamonio 100 milimolar a la resina lavada. Luego agregue 70 microlitros de la etiqueta de masa en tándem disuelta o el reactivo de etiquetado TMT, e incube durante una hora a temperatura ambiente con agitación a 850 RPM.
Guarde cualquier reactivo TMT restante a menos 80 grados centígrados. Lave la resina y vuelva a colocar el tapón. Eluya los péptidos marcados con TMT agregando 100 microlitros de tampón de bicarbonato de amonio de 100 milimolares a pH 8.0, que contiene 20 milimolares DTT, a la columna, e incubando la columna en un mezclador térmico a temperatura ambiente durante 30 minutos a 850 RPM.
Después de la incubación, realice la elución colocando la columna en un colector de vacío, aplicando el vacío y eluyendo las muestras en un tubo de microcentrífuga de cinco mililitros. Repita el paso una vez, luego agregue 100 microlitros de 80% de acetonitrilo con 0.1% de ácido trifluoroacético a la columna. Después de incubar la columna durante 10 minutos a temperatura ambiente, eluya la muestra en el mismo tubo de centrífuga de cinco mililitros.
Coloque las muestras eluyidas en un concentrador de vacío hasta que estén secas. Luego guarde los péptidos secos a menos 80 grados centígrados hasta que se sigan usando. El análisis cualitativo de muestras de péptidos de células RAW 264.7 se llevó a cabo con SDS-PAGE, donde las muestras se compararon determinando diferentes niveles de oxidación debido a los tratamientos.
Las proteínas separadas fueron posteriormente probadas por Western blot para investigar más a fondo los niveles de oxidación de proteínas individuales. Las intensidades iónicas reportadas de péptidos que contienen cistina se analizaron mediante cromatografía líquida espectrometría de masas en tándem. Se cuantificó la estequiometría de oxidación de tiol de iTRAQ, péptidos marcados enriquecidos y oxidados a niveles individuales del sitio de cistina.
Retire con cuidado la acetona sin alterar el pellet de proteína. Asegúrese de que el pellet de proteína esté completamente solubilizado y cuantificado con precisión, y que la resina se asigne con precisión a las columnas de centrifugado. Asegúrese de resuspender la resina durante los pasos de lavado.
Se puede realizar una evaluación adicional de proteínas y péptidos enriquecidos mediante SDS-PAGE y tinción, western blot y espectrometría de masas.
