La RMN cuantitativa de fósforo representa uno de los avances más significativos en la química analítica de lignina y taninos durante las últimas tres décadas. Esta técnica ofrece información rápida, confiable y cuantitativa para los diversos grupos hidroxi en la muestra. Estos métodos de RMN tienen un gran valor en la comprensión de la estructura de los lignanos y taninos.
También se ha aplicado a una variedad de otros sistemas que tienen grupos hidroxilo reactivos. Comience por el tratamiento previo de 100 miligramos de la muestra de lignina o tanino secándolo durante la noche en un horno al vacío a 40 grados centígrados. Después del secado, transfiera rápidamente la muestra a un desecador de sulfato de calcio anhidro hasta que alcance la temperatura ambiente.
Para preparar la muestra para la espectroscopia de RMN, pese con precisión unos 30 miligramos de la muestra en un vial de dos mililitros equipado con una barra de agitación. A continuación, agregue 500 microlitros de la solución solvente recién preparada al vial de muestra y selle el vial con una tapa. Usando una micropipeta, agregue 100 microlitros de la solución estándar interna al vial de muestra, luego revuelva magnéticamente la dispersión resultante a 500 rotaciones por minuto.
Cuando la muestra esté completamente disuelta, transfiera 100 microlitros de tetrametil dioxifosfolano o TMDP a la solución de muestra mientras trabaja debajo del capó y selle la solución de muestra antes de colocar la muestra para una agitación magnética vigorosa. En este punto, la reacción indicada ocurre en las muestras de lignina y tanino. Usando una pipeta Pasteur, transfiera la solución de muestra a un tubo de RMN para el análisis.
Si se observa un precipitado amarillo en la muestra, repita el procedimiento asegurándose de evitar toda la posible contaminación por humedad. Cargue el tubo de muestra en el instrumento de RMN equipado con una sonda de banda ancha y establezca los parámetros experimentales. Usando la frecuencia de resonancia del cloroformo deuterado, establezca la frecuencia en el espectrómetro.
Shim la muestra y afina el espectrómetro antes de comenzar la adquisición. Comience a procesar datos sin procesar de la espectroscopia de RMN P31 realizando la transformación de Fourier. Ajuste la corrección de fase manual expandiendo la pestaña de procesamiento y seleccionando la corrección de fase y la corrección manual.
Corrija la línea base manualmente estableciendo cuidadosamente los puntos cero después de hacer clic en el procesamiento y seleccionando la corrección de la línea base y la corrección de la línea base multipunto. Para la calibración de la señal, establezca la señal para el agua fosforilada en el valor de desplazamiento químico de 132,2 partes por millón abriendo la pestaña de análisis y, a continuación, seleccione referencia en la pestaña de referencia. Para la integración de la señal, abra integral en el menú de análisis.
Para normalizar la integración, establezca el estándar interno en 1.0 haciendo clic en el pico para seleccionar editar integral e ingrese el valor 1.00 en la pestaña normalizada, luego realice la integración del espectro de acuerdo con los cambios químicos informados en el manuscrito. Utilice la ecuación para calcular la concentración molar de la solución estándar interna, o IS, y utilice el valor calculado para estimar la cantidad equivalente de la señal específica por gramo de la muestra. La cuantificación del espectro de varios grupos hidroxi en una nave de madera blanda de lignina derivada con TMDP se registró utilizando el espectrómetro de RMN de 300 megahercios y 700 megahercios.
En los espectros de RMN, se detectaron picos agudos y fuertes a 144 y 132 PPM debido al estándar interno y la hidroxilación de TMD respectivamente. Las diferentes señales de los grupos hidroxi fueron evidentes en todos los espectros cuantitativos de RMN P31 de las ligninas. En un espectro cuantitativo de RMN P31 de una muestra de taninos derivatizada utilizando TMDP, una señal característica de las diferentes unidades alifáticas de pirogalol OH y catecol fueron bien visibles.
La comparación entre el espectro de RMN de lignina antes y después de la oxidación se registró utilizando un espectrómetro de RMN de 300 megahercios que muestra la reducción en la intensidad de los picos de los grupos hidroxi. Los pasos cruciales son los relacionados con el secado y la ponderación de la muestra y los parámetros de procesamiento de RMN que se utilizarán. Y lo más importante, la fase de los espectros obtenidos.
Cuando este método se combina con la RMN bidimensional y la cromatografía de permeación en gel, puede surgir una imagen muy detallada de los polifenoles naturales, que ofrece información estructural sin precedentes y nuevos conocimientos.
