Este protocolo muestra la producción de gusano cogollero transgénico utilizando un sistema de transformación basado en piggyBac. Esperamos que estos métodos se beneficien de mejorar la transformación, no solo en el gusano cogollero, sino también en los insectos lepidópteros. El método descrito aquí hace que la transformación de la línea germinal de los insectos plaga de lepidópteros sea eficiente.
Demostrando el procedimiento estará el Dr. Xien Chen, un becario postdoctoral en mi laboratorio. Comience colocando 12 pupas macho y 12 pupas hembra en una caja. Coloque una solución de sacarosa al 10% en la caja para alimentar a los adultos.
Cubra la caja con una toalla de papel. En el segundo día después de la eclosión, exponga a los adultos a una luz intensa durante la noche. En el tercer día después de la eclosión, transfiera a los adultos a un lugar oscuro.
Recoger los embriones dentro de las dos horas posteriores a la sobreposición. Agregue gotas de agua al trozo de la toalla de papel con huevos frescos guardados en una placa de Petri sobre hielo. Transfiera los huevos suavemente a un portaobjetos de vidrio con un cepillo fino y alinearlos uno por uno en un portaobjetos de vidrio.
Mantenga los portaobjetos de vidrio con los huevos alineados en hielo antes de la microinyección. Inyecte una mezcla de 200 nanogramos por microlitro de plásmido de expresión de EGFP basado en piggyBac, 200 nanogramos por microlitro de ARNm de transposasa de piggyBac hiperactivo y agua destilada estéril en los huevos utilizando la presión de compensación del microinyector automatizado. Mantenga los huevos inyectados a 27 más o menos un grado Celsius, 60 más o menos 10% de humedad relativa hasta la eclosión.
Alimente a las larvas eclosionadas con una dieta artificial y transfiera cada larva a una taza pequeña en la etapa temprana de cuajada y estrella. Recoge las pupas y coloca aproximadamente 150 pupas hembras y 150 machos en una jaula. Cuelgue varios trozos de toallas de papel de 30 centímetros por 15 centímetros de tamaño en la jaula para recoger los huevos.
Recoja las toallas de papel con huevos diariamente y mantenga los huevos en condiciones apropiadas hasta que eclosionen. Mantenga las larvas neonatas a cuatro grados centígrados durante cinco minutos para inmovilizarlas y luego transfiéralas a una placa helada. Examinar las larvas neonolientas inmovilizadas bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia.
Seleccione los neonatos EGFP positivos, elévelos a la etapa pupal, en aproximadamente dos semanas a 27 más o menos un grado Celsius. El ARNm hiperactivo de la transposasa piggyBac sintetizado in vitro se detectó utilizando un gel de agarosa al 1%. Los embriones inyectados con PDS no mostraron señal de EGFP, mientras que el plásmido que expresa EGFP y los embriones inyectados con ARNm de la transposasa piggyBac hiperactiva mostraron fluorescencia de EGP, lo que indica que la construcción de piggyBac fue exitosa.
Las larvas G1 obtenidas de huevos resultantes de un autocruce de adultos G0 mostraron una fuerte señal egfp. Un fragmento que contenía el promotor y el fragmento de EGFP se amplificó con éxito utilizando el ADN genómico aislado de las larvas positivas de EGFP como plantilla. Sin embargo, el mismo fragmento no se detectó cuando se aisló el ADN genómico de las larvas de tipo silvestre como plantilla.
Los huevos para la microinyección deben ser lo más frescos posible y siempre deben mantenerse en hielo antes de la microinyección para ralentizar su desarrollo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores respondan preguntas en genómica funcional de insectos plaga y desarrollen métodos de control genético para esta plaga global.
