Bugün sunduğumuz teknik, intrinsik nöronal faktörün ve çevredeki astrositlerin etkisinin bir sonucu olarak omurilik nöron aktivitesinin analizine izin vermektedir. Bu teknik, omuriliğe özgü hem insan nöronlarını hem de insan astrositlerini güvenilir bir şekilde üretir ve tekrarlanabilirlik için ölçeklendirilebilen fonksiyonel bir çıktı ölçüsü kullanır. Sunduğumuz teknik, sporadik veya genetik hastalığı olan hastaların nöronlarını kullanarak, amiyotrofik lateral skleroz gibi omurilik nöronlarına özgü hastalıkların araştırılmasına izin vermektedir.
Başlangıç olarak, insan iPSC plakalarını, kolonilerin merkezi dağınık beyaz alanlar gösterecek şekilde yeterince yoğun koloniler için inceleyin. Daha sonra hücreleri paketlemeye başlamak için, tüm plakanın doğru bir şekilde kaplanmasını kolaylaştırmak için plakaların alt dış yüzeyine bir işaretleyici ile ızgara çizgileri çizin. 200 mikrolitrelik pipet ucuyla manuel olarak kazıyarak farklılaşmış kolonileri ayırmak için bir kültürde 10x büyütmeli bir faz kontrast mikroskobu kullanın.
Ardından, plakaları PBS ile iki kez durulayın. Ve sonra 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış beş mililitre doku ayrışma proteazı ekleyin. Kolonileri plakadan kaldırmadan önce, kolonilerin kenarları yuvarlanmaya başlayana kadar hücreleri dört ila yedi dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Dissosiyasyon proteazını dikkatlice aspire edin ve kolonileri yerinden çıkarmadan plakayı PBS ile iki kez hafifçe durulayın. Kültür plakasına beş mililitre önceden ısıtılmış insan iPSC ortamı ekleyin. Ardından, yukarıdan aşağıya doğru ileri geri bir hareket kullanarak beş mililitrelik bir pipetin ucuyla tüm plakayı çizin ve kolonileri daha küçük hücre agregalarına bölerken kaldırın.
İnsan iPSC'sinin nöral progenitör hücrelere farklılaşması için. İnsan iPSC'si tek katmanlı bir tabaka oluşturduğunda ve% 90 birleştiğinde, makalede açıklandığı gibi farklılaşmaya başlayın. 12. günde, tripsin tedavisinden sonra, hücreler süspansiyonda değilse, 1000 mikrolitrelik bir pipet ucundan nöral indüksiyon ortamını, tüm yüzeyi kaplayacak dairesel bir hareketle hücrelere fırlatarak mekanik olarak hücreleri ayırır.
Nöral progenitör hücre kültürleri donmuşsa, onları çözün. Makalede tarif edildiği gibi orta değişim ve PBS durulamasından sonra, 0.02 mikromolar sitozin arabinozid içeren bir motor nöron farklılaşma ortamı ile ortamı değiştirin, daha sonra glial bağlı progenitörler post mitotik motor nöron progenitörleri altında tek çoğalan düz hücreler olarak ortaya çıktığında, hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 48 saat boyunca inkübe edin, hücre kümelerinde toplanır. Daha sonra, makalede belirtildiği gibi orta değişim gerçekleştirdi.
Kaplama gününde veya öncesinde, önce FKÖ'yü su veya PBS ile seyrelterek 24 kuyulu MEA plakalarını kaplamaya başlayın. Daha sonra, kuyunun merkezinde bir damlacık oluşturan her bir kuyuya 15 ila 20 mikrolitre FKÖ ekleyin ve elektrot alanını kaplayarak pipet ucundaki elektrotlara zarar vermemesini sağlayın. Kuyuları çevreleyen bölmelere su ekleyerek yeterli nemi sağlayın.
Ve FKÖ'yü bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra plastik bir mikro pipet ucu kullanarak, elektrotlara dokunmadan mümkün olduğunca fazla FKÖ'yü aspire edin. Daha sonra, kuyuyu üç kez 250 mikrolitre suyla yıkayın.
Bir pipet ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla su alın ve kapağı çıkarılmış olarak yüzeyin kurumasını bekleyin. Daha sonra, her elektrot dizisini örtmek için 15 ila 20 mikrolitre seyreltilmiş laminin ekleyin. Nem bölmelerine su ekledikten ve kapağı değiştirdikten sonra, gece boyunca en az iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Kaplama gününde, motor nöronları ve astrosit kültürlerini PBS ile bir kez duruladıktan sonra,% 0.05 tripsin ekleyin ve, hücreleri kaldırmak için yaklaşık beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tripsin inhibitörü içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe hücreleri toplayın. Ve tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için plakaları orta veya tabanla yıkayın.
Hücreleri merkezleme yoluyla topaklayın. Ve sonra 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, motor nöronları ve astrositleri, tek bir hücre süspansiyonunun bir mililitresini üretmek için 20 mikromolar ROCK inhibitörü içeren bir ko-kültür ortamı ile yeniden askıya alın. Bir hemositometre kullanarak, motor nöronları ve astrositleri sayın.
Ve sayarken, hücre süspansiyonlarını tuttu ve dört santigrat derecede strafor bir rafa yerleştirin. Her iki hücre süspansiyonunun bir mililitresini beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. İstenilen hacmi hesaplayın ve peletleri yeniden askıya alın.
Gerekli miktarda nöron ve astrosit süspansiyonlarını eşit oranlarda birleştirin ve iyice birleştirmek için iki kez pipetleyerek, hafifçe karıştırın. Daha sonra laminini plakanın her bir kuyucuğundan çıkarın ve son kombine hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini her bir kuyucuğa aktararak elektrot dizisini kaplayan küçük bir damlacık oluşturun. Plakalar üzerinde ilk ataşmanları oluşturmak için plakaları 37 santigrat derecede bozulmamış bir hücre damlacığı ile 20 ila 30 dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra her bir kuyucuğun duvarına ROCK inhibitörü içeren 250 mikrolitre sıcak ko-kültür ortamı pipeti ve her bir kuyucuğun karşı duvarında aynı hacimde pipet ve plakayı 24 ila 36 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, plakaları enkaz veya ölü hücreler için inceleyin. Ve gerekirse, ortamı ROCK inhibitörü içeren taze bir ko-kültür ortamı ile değiştirin.
Aksi takdirde, ikinci günden başlayarak ROCK inhibitörü olmayan bir ko-kültür ortamı kullanarak haftada iki kez yarım orta değişim gerçekleştirin. Kayıt yapmak için, ortak kültür gününden sonra sıcaklığı 37 santigrat dereceye ve karbondioksiti% 5'e ayarlayarak mümkün olan en kısa sürede başlayınArdından plakaları kayıt makinesine aktarın ve kayıttan önce en az beş dakika dengeleyin. Deneysel tasarıma bağlı olarak her gün veya haftalık olarak bir ila 15 dakika boyunca temel aktiviteyi kaydedin.
Nöronları veya astrositleri hedef alan bileşiklerin geçici elektrofizyolojik etkilerini araştırmak için, plaka kapağını çıkarın, ancak makine kapağını kapalı tutun ve en az bir dakika boyunca temel aktiviteyi kaydedin. Elektrofizyolojik kaydı durdurmadan makine kapağını manuel olarak açın ve 25 mikrolitre ortamı uygun ilaç aracıyla değiştirin. Ardından kapağı manuel olarak kapatın ve gerekirse birkaç dakika daha kaydedin.
Benzer şekilde, ilgilendiğiniz ilacı test edin. Bu protokolde, hiPSC'ler akıcı-olmayan koloniler olarak korunmuş ve geçirilmiştir. Nörogenez, BMP ve TGF-beta yolaklarının inaktive edilmesiyle ikili SMAD inhibisyonu ile başlatıldı.
Ortaya çıkan nöro epitel kök hücreleri bölündü ve çok katmanlı bir epitel oluşturdu. Nöronal büyüme faktörlerine ve gliojenik siliyer nörotrofik faktöre erken maruz kalma, karışık bir progenitör hücre popülasyonu oluşturdu. Nöronlar bu karışık popülasyondan kendiliğinden ortaya çıktı.
Gliojenik anahtar, JAK-STAT yolunun aktivasyonu yoluyla astrosit farklılaşmasını indükledi. Çentik inhibitörü ile tedavi edilen ve farklılaşan motor nöron hücrelerinin omurilik kimliği, yüksek kolin asetiltransferaz ekspresyon düzeyleri ile desteklendi. In vitro kültürden 90. gün sonrasında, insan iPSC astrositleri S100 beta ve GFAP ekspresyonu ile belirtildiği gibi olgunlaşan fenotip sergilerken, omurilik bölgesel kimlikleri daha önce şahinlerin ekspresyonu ile desteklendi.
Ko-kültürlü hücreler, altta bir beslenme tabakası oluşturan astrositler ve üstte ağları birbirine bağlayan nöronlarla kendiliğinden yeniden düzenlendi. Nöronlar tek başına kültürlendiğinde büyük hücre kümelerinde toplanırken, insan iPSC motor nöronlarının insan iPSC astrositleriyle birlikte kültürlenmesi, eşit olarak dağılmış tek katmanlarla sonuçlandı. İnsan iPSC astrositleri, insan iPSC motor nöronlarının elektrofizyolojik olgunlaşmasını, ortak kültürlerde daha yüksek derecelerde ani ve patlama aktivitesi ile gösterildiği gibi arttırdı.
Deneyimlerimize göre, kök hücre kültürü ve erken NPC farklılaşması teknik hatalara karşı en zor ve hassas olanlardır. Bu aşamada, teknikler sorun giderme için çok az marjla tutarlılık ve doğrulukla gerçekleştirilmemelidir. Burada açıklanan ko-kültür teknikleri, diğer hücre tipine özgü modellerde de kullanılabilir.
