A técnica que apresentamos hoje permite a análise da atividade dos neurônios da medula espinhal como resultado do fator neuronal intrínseco e da influência dos astrócitos circundantes. Esta técnica gera de forma confiável neurônios humanos e astrócitos humanos que são específicos da medula espinhal e usa uma medida de saída funcional que pode ser dimensionada para reprodutibilidade. A técnica que apresentamos permite investigar doenças específicas dos neurônios da medula espinhal, como a esclerose lateral amiotrófica, usando neurônios de pacientes com doença esporádica ou genética.
Para começar, examine as placas iPSC humanas em busca de colônias suficientemente densas, de modo que o centro das colônias exiba áreas brancas dispersas. Em seguida, para começar a embalar as células, desenhe linhas de grade na superfície externa inferior das placas com um marcador para facilitar a cobertura precisa de toda a placa. Use um microscópio de contraste de fase de ampliação de 10x em um campo de cultura para separar colônias diferenciadas raspando manualmente com uma ponta de pipeta de 200 microlitros.
Em seguida, lave as placas duas vezes com PBS. E, em seguida, adicione cinco mililitros de protease de dissociação tecidual pré-aquecida a 37 graus Celsius. Incube as células a 37 graus Celsius por quatro a sete minutos até que as bordas das colônias comecem a arredondar, antes de levantar as colônias da placa.
Aspirar cuidadosamente a protease de dissociação e enxaguar suavemente a placa duas vezes com PBS sem desalojar as colónias. Adicione cinco mililitros de meio iPSC humano pré-aquecido à placa de cultura. Em seguida, risque toda a placa com uma ponta de uma pipeta de cinco mililitros usando um movimento de ida e volta de cima para baixo e levante as colônias enquanto as quebra em agregados celulares menores.
Para diferenciação de iPSC humana em células progenitoras neurais. Uma vez que a iPSC humana forma uma monocamada e se torna 90% confluente, inicie a diferenciação conforme descrito no manuscrito. No 12º dia, após o tratamento com tripsina, se as células não estiverem em suspensão, separaram as células mecanicamente ejetando o meio de indução neural de uma ponta de pipeta de 1000 microlitros para as células com um movimento circular para cobrir toda a superfície.
Se as culturas de células progenitoras neurais foram congeladas, descongele-as. Após troca de meio e enxágue PBS, conforme descrito no manuscrito, alterar o meio com um meio de diferenciação de neurônios motores contendo 0,02 citosina micromolar arabinosídeo e, em seguida, incubar as células por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono quando os progenitores gliais comprometidos emergirem como células planas de proliferação única sob progenitores de neurônios motores pós-mitóticos, agregados em aglomerados de células. Posteriormente, realizou troca de médiuns conforme indicado no manuscrito.
No dia do chapeamento ou antes, comece a revestir as placas MEA de 24 poços diluindo primeiro a OLP em água ou PBS. Em seguida, adicione 15 a 20 microlitros de PLO a cada poço formando uma gota no centro do poço, cobrindo a área do eletrodo garantindo não danificar os eletrodos com a ponta da pipeta. Adicione água aos compartimentos ao redor dos poços, garantindo umidade suficiente.
E incubar a OLP a 37 graus Celsius por uma a duas horas. Em seguida, usando uma ponta de micropipeta de plástico, aspirar o máximo de PLO possível sem tocar nos eletrodos. Em seguida, lave o poço com 250 microlitros de água três vezes.
Usando uma ponta de pipeta, remova o máximo de água possível e deixe a superfície secar com a tampa removida. Em seguida, adicione 15 a 20 microlitros de laminina diluída para cobrir cada matriz de eletrodos. Depois de adicionar água aos compartimentos de umidade e substituir a tampa, incube a 37 graus Celsius por um mínimo de duas horas até a noite.
No dia do revestimento, depois de enxaguar os neurônios motores e as culturas de astrócitos uma vez com PBS, adicione 0,05% de tripsina e incube a 37 graus Celsius por cerca de cinco minutos para levantar as células. Colete as células em um tubo cônico de 15 mililitros contendo inibidor de tripsina. E lave as placas com meio ou base para garantir que todas as células sejam coletadas.
Pellet para baixo as células por centrificação. E, em seguida, usando uma pipeta de 1000 microlitros, ressussuscite neurônios motores e astrócitos com um meio de co-cultura contendo 20 micromolares de inibidor de ROCK para gerar um mililitro de uma única suspensão celular. Usando um hemocitômetro, conte os neurônios motores e astrócitos.
E durante a contagem, manteve as suspensões celulares e colocou-as em um rack de isopor a quatro graus Celsius. Centrifugar um mililitro de ambas as suspensões celulares a 300 vezes G durante cinco minutos. Calcule o volume desejado e ressuspenda os pellets.
Combine o volume necessário de suspensões de neurônios e astrócitos em proporções iguais e misture suavemente pipetando duas vezes para combinar completamente. Em seguida, remova a laminina de cada poço da placa e transfira 10 microlitros da suspensão celular combinada final para cada poço, formando uma pequena gotícula cobrindo a matriz de eletrodos. Incubar as placas com uma gotícula de célula não perturbada a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos para formar anexos iniciais nas placas.
Em seguida, pipetar 250 microlitros de meio de co-cultura quente contendo inibidor de ROCK na parede de cada poço e pipetar o mesmo volume na parede oposta de cada poço e incubar a placa a 37 graus Celsius por 24 a 36 horas. No dia seguinte, examine as placas em busca de detritos ou células mortas. E, se necessário, troque o meio por um meio de co-cultura fresco contendo inibidor de ROCK.
Caso contrário, realize trocas médias duas vezes por semana usando um meio de co-cultura sem um inibidor de ROCK a partir do segundo dia de cocultura. Para realizar a gravação, comece o mais rápido possível após o primeiro dia de cocultura, ajustando a temperatura para 37 graus Celsius e dióxido de carbono a 5% Em seguida, transfira as placas para a máquina de gravação e equilibre-se por pelo menos cinco minutos antes da gravação. Registre a atividade de linha de base a cada dois dias ou semanalmente durante um a 15 minutos, dependendo do desenho experimental.
Para investigar os efeitos eletrofisiológicos transitórios de compostos direcionados a neurônios ou astrócitos, remova a tampa da placa, mas mantenha a tampa da máquina fechada e registre a atividade basal por um mínimo de um minuto. Abra manualmente a tampa da máquina sem parar o registro eletrofisiológico e troque 25 microlitros de meio com o veículo de droga apropriado. Em seguida, feche a tampa manualmente e grave por mais minutos, se necessário.
Da mesma forma, teste a droga de interesse. Neste protocolo, as hiPSCs foram mantidas e passadas como colônias não confluentes. A neurogênese foi iniciada através da inibição dupla da SMAD, inativando as vias BMP e TGF-beta.
As células-tronco neuroepiteliais resultantes se dividiram e geraram um epitélio de várias camadas. A exposição precoce a fatores de crescimento neuronais e um fator neurotrófico ciliar gliogênico geraram uma população mista de células progenitoras. Os neurônios emergiram espontaneamente dessa população mista.
O interruptor gliogênico induziu a diferenciação de astrócitos através da ativação da via JAK-STAT. A identidade da medula espinhal das células do neurônio motor tratadas e diferenciadas do inibidor da entalhe foi apoiada por altos níveis de expressão da acetiltransferase de colina. No 90º dia pós-cultura in vitro, os astrócitos humanos de iPSC apresentaram fenótipo de maturação, conforme indicado pela expressão de S100 beta e GFAP, enquanto sua identidade regional da medula espinhal foi apoiada pela expressão de falcões antes.
Células co-cultivadas rearranjadas espontaneamente com astrócitos criando uma camada de alimentação na parte inferior e neurônios conectando redes na parte superior. Neurônios agregados em grandes aglomerados de células quando cultivados sozinhos, enquanto a co-cultura de neurônios motores iPSC humanos com astrócitos iPSC humanos resultou em monocamadas uniformemente distribuídas. Os astrócitos humanos da iPSC aumentaram a maturação eletrofisiológica dos neurônios motores da iPSC humana, como mostrado por graus mais altos de atividade de pico e explosão nas coculturas.
Em nossa experiência, a cultura de células-tronco e a diferenciação precoce de NPCs são as mais difíceis e sensíveis a erros técnicos. Nesta fase, as técnicas não devem ser executadas com consistência e precisão, com pouca margem para solução de problemas. As técnicas de co-cultura descritas aqui também podem ser usadas em outros modelos específicos de tipo celular.
