今日紹介する技術は、内因性の神経因子と周囲の星状細胞の影響の結果としての脊髄ニューロン活動の分析を可能にします。この技術は、脊髄特異的なヒトニューロンとヒトアストロサイトの両方を確実に生成し、再現性のためにスケーリングできる機能的出力測定値を使用します。本研究では、孤発性または遺伝性疾患の患者のニューロンを用いて、筋萎縮性側索硬化症などの脊髄ニューロン特異的疾患を調査することができます。
まず、ヒトiPSプレートを調べて、コロニーの中心に白い領域が散在するように十分に密度の高いコロニーがないか調べます。次に、セルのパッケージングを開始するには、プレートの下部外面にマーカーを使用してグリッド線を描画し、プレート全体を正確にカバーできるようにします。培養液中で倍率10倍の位相差顕微鏡を使用し、200マイクロリットルのピペットチップで手動でこすり落とすことで分化したコロニーを剥離します。
次に、プレートをPBSで2回すすぎます。次に、摂氏37度に予熱した5ミリリットルの組織解離プロテアーゼを加えます。プレートからコロニーを持ち上げる前に、コロニーの端が切り上げ始めるまで摂氏37度で細胞を4〜7分間インキュベートします。
解離プロテアーゼを注意深く吸引し、コロニーを脱落させずにプレートをPBSで2回穏やかにすすぎます。培養プレートに5ミリリットルの予熱したヒトiPS細胞培地を加えます。次に、上から下に前後に動かして、5ミリリットルのピペットの先端でプレート全体を引っ掻き、コロニーをより小さな細胞凝集体に分割しながら持ち上げます。
ヒトiPS細胞の神経前駆細胞への分化に。ヒトiPS細胞が単層を形成し、90%コンフルエントになったら、原稿に記載されているように分化を開始します。12日目に、トリプシン処理後、細胞が懸濁状態でない場合は、1000マイクロリットルのピペットチップから神経誘導培地を細胞上に円運動で吐出して細胞を機械的に剥離し、表面全体を覆う。
神経前駆細胞培養物が凍結されている場合は、それらを解凍する。原稿に記載されている培地交換とPBSリンスの後、0.02マイクロモルのシトシンアラビノシドを含む運動ニューロン分化培地で培地を交換し、グリアコミット前駆細胞が有糸分裂後運動ニューロン前駆細胞の下で単一の増殖扁平細胞として出現したときに、摂氏37度と5%二酸化炭素で48時間細胞をインキュベートします。 セルクラスターに集約されます。その後、原稿に示されているように培地交換を行った。
めっき当日またはそれ以前に、最初にPLOを水またはPBSで希釈することにより、24ウェルMEAプレートのコーティングを開始します。次に、各ウェルに15〜20マイクロリットルのPLOを加えてウェルの中央に液滴を形成し、ピペットチップで電極を損傷しないように電極領域を覆います。井戸を囲む区画に水を加え、十分な湿度を確保します。
そして、PLOを摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。次にプラスチック製のマイクロピペットチップを用いて、電極に触れずにできるだけ多くのPLOを吸引する。次に、井戸を250マイクロリットルの水で3回洗浄します。
ピペットチップを使用して、できるだけ多くの水を取り除き、蓋を外した状態で表面を乾かします。次に、各電極アレイを覆うために15〜20マイクロリットルの希釈ラミニンを追加します。湿度コンパートメントに水を加えて蓋を交換した後、摂氏37度で最低2時間から一晩インキュベートします。
プレーティング当日、運動ニューロンとアストロサイト培養物をPBSで1回すすいだ後、0.05%トリプシンを加え、摂氏37度で約5分間インキュベートして細胞を持ち上げます。トリプシン阻害剤を含む15ミリリットルの円錐管に細胞を収集します。そして、プレートを培地またはベースで洗浄して、すべての細胞が確実に収集されるようにします。
遠心分離によって細胞をペレット化します。次いで、1000マイクロリットルのピペットを用いて、運動ニューロンおよびアストロサイトを20マイクロモルのROCK阻害剤を含む共培養培地で再懸濁し、1ミリリットルの単一細胞懸濁液を生成する。血球計算盤を使用して、運動ニューロンと星状細胞を数えます。
そして数えながら、細胞懸濁液を保管し、摂氏4度の発泡スチロールラックに入れます。両方の細胞懸濁液1ミリリットルを300倍Gで5分間遠心分離する。所望の体積を計算し、ペレットを再懸濁する。
必要量のニューロンとアストロサイト懸濁液を等しい比率で混ぜ合わせ、2回ピペッティングして穏やかに混合して完全に混ぜ合わせます。次に、プレートの各ウェルからラミニンを除去し、10マイクロリットルの最終合わせ細胞懸濁液を各ウェルに移し、電極アレイを覆う小さな液滴を形成します。プレートを乱されていない細胞液滴で摂氏37度で20〜30分間インキュベートし、プレートに最初の付着物を形成します。
次に、ROCK阻害剤を含む250マイクロリットルの温かい共培養培地を各ウェルの壁にピペットで置き、各ウェルの反対側の壁に同じ容量のピペットを置き、プレートを摂氏37度で24〜36時間インキュベートします。翌日、プレートに破片や死んだ細胞がないか調べます。そして必要に応じて、ROCK阻害剤を含む新鮮な共培養培地と培地を交換します。
それ以外の場合は、共培養2日目からROCK阻害剤を含まない共培養培地を使用して、週に2回ハーフ培地交換を行います。記録を行うには、共培養初日からできるだけ早く温度を摂氏37度に設定し、二酸化炭素を5%に設定してからプレートを記録機に移し、少なくとも5分間平衡化してから記録します。実験デザインに応じて、ベースラインアクティビティを隔日または毎週1〜15分記録します。
ニューロンまたはアストロサイトを標的とする化合物の一時的な電気生理学的影響を調べるには、プレートの蓋を取り外しますが、機械の蓋を閉じたままにして、ベースライン活動を最低1分間記録します。電気生理学的記録を停止せずに機械の蓋を手動で開き、25マイクロリットルの培地を適切な薬剤ビヒクルと交換します。次に、蓋を手動で閉じ、必要に応じてさらに数分間記録します。
同様に、目的の薬をテストします。このプロトコルでは、hiPS細胞は非コンフルエントなコロニーとして維持および継代されました。神経新生は、BMPおよびTGF-β経路を不活性化することによる二重SMAD阻害によって開始された。
得られた神経上皮幹細胞が分裂し、多層上皮を生成した。神経細胞成長因子とグリオジェニック毛様体神経栄養因子への早期曝露は、前駆細胞の混合集団を生成した。ニューロンは、この混合集団から自発的に出現した。
グリオジェニックスイッチは、JAK-STAT経路の活性化を通じて星状細胞の分化を誘導しました。ノッチ阻害剤で処理され分化した運動ニューロン細胞の脊髄同一性は、高いコリンアセチルトランスフェラーゼ発現レベルによって支持された。in vitro培養後90日目に、ヒトiPS細胞アストロサイトはS100ベータおよびGFAP発現によって示される成熟表現型を示し、それらの脊髄局所同一性は以前のタカの発現によって支持された。
共培養された細胞は、アストロサイトが下部に摂食層を形成し、上部にネットワークを接続するニューロンと自発的に再配列しました。ニューロンは、単独で培養すると大きな細胞クラスターに凝集し、ヒトiPS運動ニューロンとヒトiPS細胞アストロサイトの共培養では、単層が均一に分布しました。ヒトiPS細胞アストロサイトは、共培養におけるより高い程度のスパイクおよびバースト活性によって示されるように、ヒトiPS細胞運動ニューロンの電気生理学的成熟を増強した。
私たちの経験では、幹細胞培養と早期NPC分化は最も困難であり、技術的エラーに敏感です。この段階では、トラブルシューティングの余地がほとんどなく、一貫性と精度で手法を実行してはなりません。ここで説明する共培養技術は、他の細胞型特異的モデルでも同様に使用することができる。
