Utilizamos este protocolo para hacer células progenitoras neurales de fibroblastos de la piel del paciente y estudiar enfermedades neurológicas y neurodegenerativas. Sentimos que este protocolo tiene muchas ventajas sobre la tecnología IPS clásica, incluida la velocidad, pero también conseguir en ciertos casos un fenotipo de enfermedad más grave. Estudiamos enfermedades neurológicas y neurodegenerativas y el uso de muestras de piel nos permite evaluar realmente la diversidad de los pacientes también.
Mi laboratorio está particularmente interesado en el papel de los astrocitos en las enfermedades y utilizamos los astrocitos que hacemos de los NPCs para probar medicamentos y también para estudiar los mecanismos de la enfermedad, pero también en co-cultivos con neuronas humanas y de ratón. Esperamos que este protocolo va a ser informativo y comuníquese si tiene alguna pregunta. Gracias.
Use fibroblastos primarios de la piel humana que se pueden obtener de bancos celulares o biopsias de piel. Células de cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos al 5%CO2. Las células de paso durante al menos uno o dos pasajes después de la descongelación antes de su uso en el experimento.
Una vez que las células estén listas, recubra un pozo de una placa de seis pozos con fibronectina humana a una concentración de 1:200 diluida en PBS a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. Prepare los medios del fibroblasto como se muestra en la tabla una. Cuando las células estén listas para ser plateadas, retire la fibronectina del plato y agregue inmediatamente la solución celular o dos milésimas de medio fibroblasto.
No dejes que el plato se seque antes de añadir medios. Dependiendo de qué tan rápido crezcan las células, placa 150, 000 a 200, 000 fibroblastos en dos pozos de una placa humana de seis pozos recubierta de fibronectina. Células de cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos al 5%CO2.
El día después de la siembra, revise los fibroblastos bajo el microscopio y verifique que la densidad celular esté entre 70 a 85%Transducir un pozo con los cuatro vectores retrovirales: Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc. Utilice una multiplicidad de infección de 10 para los fibroblastos de crecimiento rápido o de 15 para los fibroblastos de crecimiento lento. La eficiencia de transducción debe superar el 70% o más de células positivas para cada vector.
Agregue el medio de fibroblasto regular a la mezcla viral para un volumen total de una mil por pozo. Deje el segundo pozo sin tratar y devuelva las células a la incubadora de cultivo de tejidos para incubar durante la noche. Al día siguiente de la transducción, lave las células una vez con PBS y agregue un medio de fibroblastos frescos mil.
Células de cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos al 5%CO2. Al día siguiente, prepare los medios de conversión como se muestra en la tabla uno y lave las células una vez con PBS para deshacerse de los medios de fibroblastos residuales, luego agregue una mil de medio de conversión. Cambie los medios del pozo no tratado a medios de conversión también.
Observe las células bajo el microscopio y observe si hay cambios en morfología. Los medios celulares deben reemplazarse diariamente durante todo el proceso de conversión con uno a dos milésimas de medios de conversión y para el cultivo posterior de iNPC. Cambie los medios eliminando cuidadosamente el 70% de los medios del pozo mientras se asegura de que las celdas permanezcan cubiertas en el 30% restante de los medios.
Continúe observando las celdas y cambie los medios diariamente con uno o dos milésimas de medios de conversión. Después de unos cinco a seis días en medios de conversión o cuando las células se vuelven muy densas, pasarlos de uno a dos o máximo uno a tres. Caliente Accutase y cubra un número apropiado de pozos en una placa de seis pozos con un mil de fibronectina total diluida 1:200 en PBS durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente.
Lave las células cuidadosamente con PBS sin separar ninguna célula. Utilice la pared del pozo para aplicar PBS suavemente a las células. Retire cuidadosamente el PBS con pipetas o aspirando.
Añadir 500 microlitros Accutase e incubar de dos a tres minutos a 37 grados Centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos. Compruebe bajo el microscopio para verificar que la mayoría de las células se han desprendido. Si las células se han desprendido, agregue dos milésimas de medios de conversión frescos y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo de dos a tres veces para disociar los grupos.
Recoger las células en un tubo de 15 mil y añadir tres mils medios para diluir aún más el Accutase. Centrífuga durante cuatro minutos a 200 G a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante de la pastilla celular y resuspend las células en un mil de medio fresco.
Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo de dos a tres veces para resolver los grupos celulares. Retire la fibronectina de seis pozos recubiertos y agregue un mil de medios frescos a cada pozo inmediatamente. Para una relación de división de 1:2, agregue 500 microlitros de la suspensión celular en un pozo y los otros 500 en un segundo pozo.
Distribuya las células agitando suavemente los seis pozos en dirección norte-sur este-oeste y coloque una incubadora de cultivo de tejidos de 37 grados. Observe las células bajo el microscopio al día siguiente y cambie los medios con uno o dos mils. Cambie los medios todos los días hasta que las celdas estén listas para dividirse de nuevo.
Preparar medios NPC que contengan FGF a mayor concentración sin EGF o heparina como se ve en la tabla uno. En esta nueva división, sembra un pozo de células en medios de conversión y el otro pozo en medios NPC. Siga cambiando los medios de los iNPCs diariamente con uno a dos mils de medios NPC.
Preparar medios de astrocitos de acuerdo con la tabla uno. Para hacer astrocitos a partir de iNPCs frescos, sembra iNPCs directamente en 10 mils de medios de astrocitos en placas recubiertas de fibronectina de 10 centímetros para que estén alrededor del 10% de confluencia al día siguiente. Células de cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos al 5%CO2.
Cambie el medio con 10 mils de medios de astrocitos tres días después del revestimiento. Mantenga las células diferenciando durante cinco a siete días. Para sembrar para experimentación, divida los astrocitos usando tripsina o Accutase como se describe en el paso 2 a 2.6.
Las densidades de siembra recomendadas se incluyen en la tabla dos. Las instrucciones sobre cómo porciones de iNPCs para generar astrocitos inducidos se encuentran en la tabla tres. Para hacer astrocitos de las existencias congeladas de iNPC, retire el archivo de porción del tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido y descongele rápidamente a 37 grados Celsius.
Tan pronto como las células se descongela, solución de células pipeteadas en un tubo de 15 mil que contiene cinco mils de medios de astrocitos. Centrífuga durante cuatro minutos a 200 G a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y resuspend en un medio de astrocitos fresco mil.
Agregue nueve mils de medio de astrocitos frescos a un plato de 10 centímetros recubierto de fibronectina y agregue una solución de mil células, distribuyendo suavemente las células en movimiento norte-sur este-oeste. Células de cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos al 5%CO2. Este protocolo permite la generación rápida y fácil de iNPCs directamente de fibroblastos de la piel humana usando retrovirus que contienen los factores de Yamanaka.
Este método permite evitar el estado de las células madre y la necesidad de selección clonal, evitando así la variación clonal. Los pasos importantes a tener en cuenta mientras las células se someten al proceso de conversión son la densidad de siembra de fibroblastos, el pH de los medios y el mantenimiento de las células en una confluencia óptima. Ejemplos de cambios óptimos de confluencia y morfología durante el proceso de conversión se pueden encontrar en la figura uno.
Una vez completado el proceso de conversión, los NPCs mostrarán una expresión fuertemente reducida o ninguna expresión de los marcadores de fibroblastos y la morfología y los marcadores celulares específicos de NPC. Por otra parte, también se pueden utilizar para generar diferentes líneas celulares como neuronas inducidas, oligodendrocitos, y astrocitos. En nuestra experiencia, los astrocitos inducidos en particular son muy valiosos para las pruebas de mecanismos de fármacos y enfermedades, ya que se pueden generar en poblaciones puras en grandes cantidades reproducibles.
Los astrocitos inducidos se pueden diferenciar de los iNPCs tomando una pequeña alícuota de células durante la división o una porción de iNPC previamente congelada y directamente enchapado en medios de astrocitos. Las consideraciones importantes durante este proceso son mantener la densidad de siembra inicial de los iNPCs baja, ya que se ha demostrado que una alta densidad de siembra dificulta el proceso de diferenciación, y prestar atención adicional al pH de los medios, ya que la acidificación puede activar incluso astrocitos sanos. En resumen, el protocolo de conversión directa es un método muy rápido para poder hacer células progenitoras neurales a partir de muestras de piel de pacientes.
Esto permite estudiar un mayor número de muestras de células al mismo tiempo y realmente observar la diversidad en el contexto de la enfermedad. Creemos que este es un ensayo muy fuerte que se puede utilizar para hacer células progenitoras neuronales, neuronas, sino también astrocitos que luego se pueden utilizar ya sea en co-cultivo o por sí mismos para pruebas de drogas o estudios mecanicistas, así.
