הטכניקה שאנו מציגים כיום מאפשרת ניתוח של פעילות נוירוני חוט השדרה כתוצאה מגורם עצבי פנימי והשפעת אסטרוציטים מסביב. טכניקה זו מייצרת באופן אמין הן נוירונים אנושיים והן אסטרוציטים אנושיים ספציפיים לחוט השדרה ומשתמשת במדד פלט פונקציונלי שניתן לשנות את קנה המידה שלו לצורך שחזור. הטכניקה שאנו מציגים מאפשרת לחקור נוירונים בעמוד השדרה מחלות ספציפיות כגון טרשת אמיוטרופית צידית, באמצעות נוירונים מחולים עם מחלה ספורדית או גנטית.
ראשית, בחנו את לוחות iPSC האנושיים עבור מושבות צפופות מספיק, כך שבמרכז המושבות יוצגו אזורים לבנים מפוזרים. לאחר מכן כדי להתחיל לארוז את התאים, ציירו קווי רשת על המשטח החיצוני התחתון של הלוחות עם סמן כדי להקל על כיסוי מדויק של הצלחת כולה. השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה של הגדלה פי 10 בתרבית כדי לנתק מושבות מובחנות על ידי גירוד ידני עם קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר.
לאחר מכן, שטפו את הצלחות פעמיים עם PBS. ואז להוסיף חמישה מיליליטר של פרוטאז דיסוציאציה רקמות מחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד שבע דקות עד ששולי המושבות מתחילים להתעגל כלפי מעלה, לפני הרמת מושבות מהצלחת.
שאפו בזהירות את פרוטאז הדיסוציאציה ושטפו בעדינות את הצלחת פעמיים עם PBS מבלי לעקור את המושבות. הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום iPSC אנושי שחומם מראש לצלחת התרבית. לאחר מכן מגרדים את הצלחת כולה עם קצה של פיפטה של חמישה מיליליטר באמצעות תנועה קדימה ואחורה מלמעלה למטה ומרימים את המושבות תוך פירוקן לצברי תאים קטנים יותר.
להתמיינות של iPSC אנושי לתאי אב עצביים. ברגע שתאי גזע פלוריפוטנטיים מובנים אנושיים יוצרים שכבה אחידה והופכים ל-90% מתמזגים, התחילו בהבחנה כמתואר בכתב היד. ביום ה -12, לאחר הטיפול בטריפסין, אם התאים אינם בהשעיה, ניתקו תאים באופן מכני על ידי פליטת מדיום אינדוקציה עצבי מקצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר אל התאים בתנועה מעגלית כדי לכסות את כל פני השטח.
אם תרביות תאי האב העצביים הוקפאו, הפשירו אותן. לאחר החלפת מדיום ושטיפת PBS כמתואר בכתב היד, יש לשנות את התווך עם מדיום התמיינות נוירון מוטורי המכיל 0.02 מיקרומולרי ציטוזין ארבינוזיד ואז לדגור על התאים במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני כאשר אבות גליה מחויבים מופיעים כתאים שטוחים בודדים המתרבים תחת אבות נוירון מוטורי פוסט מיטוטי, מצטבר באשכולות תאים. מאוחר יותר, ביצע חילופי בינוניים כפי שמצוין בכתב היד.
ביום הציפוי או לפניו, התחל לצפות את 24 לוחות MEA באר על ידי דילול ראשון אש"ף במים או PBS. לאחר מכן להוסיף 15 עד 20 מיקרוליטר של אש"ף לכל באר וליצור טיפה על מרכז הבאר, מכסה את אזור האלקטרודה להבטיח לא לפגוע אלקטרודות עם קצה פיפטה. הוסיפו מים לתאים המקיפים בארות, ובטיחו לחות מספקת.
ולדגור על אש"ף בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן באמצעות קצה מיקרו פיפטה פלסטיק, לשאוף אש"ף ככל האפשר מבלי לגעת באלקטרודות. לאחר מכן, לשטוף את הבאר עם 250 מיקרוליטר מים שלוש פעמים.
בעזרת קצה פיפטה, מוציאים כמה שיותר מים ונותנים למשטח להתייבש כשהמכסה מוסר. לאחר מכן, להוסיף 15 עד 20 מיקרוליטר של למינין מדולל כדי לכסות כל מערך אלקטרודות. לאחר הוספת מים לתאי הלחות והחלפת המכסה, יש לדגור בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות עד הלילה.
ביום הציפוי, לאחר שטיפת הנוירונים המוטוריים ותרביות האסטרוציטים פעם אחת עם PBS, מוסיפים 0.05% טריפסין ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כחמש דקות כדי להרים תאים. לאסוף תאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל מעכב טריפסין. ולשטוף צלחות עם בינוני או בסיס כדי להבטיח כי כל התאים נאספים.
פלטו את התאים על ידי צנטריפיקציה. ולאחר מכן באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר, להשהות מחדש נוירונים מוטוריים ואסטרוציטים עם מדיום תרבית משותפת המכיל 20 מיקרומולר של מעכב ROCK כדי ליצור מיליליטר אחד של תרחיף תא בודד. באמצעות המוציטומטר, לספור את נוירונים מוטוריים אסטרוציטים.
ובזמן הספירה, שמרו על מתלי התאים והניחו אותם במתלה קלקר בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה מיליליטר אחד של שני מתלי התא ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. חשב את עוצמת הקול הרצויה והשהה מחדש את הכדורים.
ערבבו את הנפח הנדרש של מתלי נוירונים ואסטרוציטים ביחסים שווים, וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג פעמיים כדי לשלב היטב. לאחר מכן להסיר laminin מכל באר של הצלחת ולהעביר 10 מיקרוליטר של השעיית התא המשולב הסופי לכל באר, יצירת טיפה קטנה המכסה את מערך האלקטרודות. דגרו על הצלחות עם טיפת תא ללא הפרעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות כדי ליצור חיבורים ראשוניים על הצלחות.
לאחר מכן פיפטה 250 מיקרוליטר של מדיה חמה לתרבית משותפת המכילה מעכב ROCK למטה על הקיר של כל באר ופיפטה באותו נפח על הקיר הנגדי של כל באר ולדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 עד 36 שעות. למחרת, בדקו את הלוחות לאיתור פסולת או תאים מתים. ואם נדרש, החליפו את המדיום במדיום תרבית משותפת רענן המכיל מעכב רוק.
אחרת, בצעו החלפות חצי בינוניות פעמיים בשבוע באמצעות מדיום תרבות משותפת ללא מעכב ROCK החל מהיום השני של התרבות המשותפת. כדי לבצע הקלטה, התחל בהקדם האפשרי לאחר היום הראשון של התרבית המשותפת על ידי הגדרת הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני על 5%, לאחר מכן העבר את הצלחות למכונת ההקלטה ושיווי משקל לפחות חמש דקות לפני ההקלטה. הקלט פעילות בסיסית כל יומיים או שבועיים במשך דקה עד 15 דקות, בהתאם לתכנון הניסוי.
כדי לחקור את ההשפעות האלקטרופיזיולוגיות החולפות של תרכובות המכוונות לנוירונים או לאסטרוציטים, הסירו את מכסה הצלחת אך השאירו את מכסה המכונה סגור ותיעדו את הפעילות הבסיסית למשך דקה אחת לפחות. פתח ידנית את מכסה המכונה מבלי לעצור את ההקלטה האלקטרופיזיולוגית והחלף 25 מיקרוליטר של מדיום עם רכב התרופה המתאים. לאחר מכן סגור את המכסה באופן ידני והקלט למשך דקות נוספות במידת הצורך.
באופן דומה, לבדוק את התרופה של עניין. בפרוטוקול זה, hiPSCs נשמרו ועברו כמושבות לא מתמזגות. נוירוגנזה החלה באמצעות עיכוב SMAD כפול על ידי השבתת מסלולי BMP ו- TGF-beta.
תאי הגזע הנוירו-אפיתליאליים שנוצרו התחלקו ויצרו אפיתל רב-שכבתי. החשיפה המוקדמת לגורמי גדילה עצביים ולגורם נוירוטרופי ריסני גליוגני יצרה אוכלוסייה מעורבת של תאי אב. תאי עצב הופיעו באופן ספונטני מאוכלוסייה מעורבת זו.
המתג הגליוגני גרם להתמיינות אסטרוציטים באמצעות הפעלת מסלול JAK-STAT. זהות חוט השדרה של תאי נוירון מוטוריים שטופלו והתמינו במעכבי חריץ נתמכה על ידי רמות ביטוי גבוהות של כולין אצטילטרנספראז. ביום ה-90 לאחר תרבית המבחנה, אסטרוציטים iPSC אנושיים הציגו פנוטיפ מתבגר כפי שצוין על ידי ביטוי S100 beta ו-GFAP בעוד הזהות האזורית של חוט השדרה שלהם נתמכה על ידי ביטוי של נצים בעבר.
תאים בתרבית משותפת מסודרים מחדש באופן ספונטני עם אסטרוציטים היוצרים שכבת הזנה בתחתית ותאי עצב המחברים רשתות בחלק העליון. תאי עצב הצטברו בצברי תאים גדולים כאשר גודלו בתרבית בלבד, בעוד שהתרבית המשותפת של נוירונים מוטוריים מסוג iPSC אנושי עם אסטרוציטים של iPSC אנושיים הביאה לתפוצה אחידה של חד-שכבות. אסטרוציטים iPSC אנושיים שיפרו את ההבשלה האלקטרופיזיולוגית של תאי עצב מוטוריים iPSC אנושיים, כפי שמוצג על ידי דרגות גבוהות יותר של פעילות דוקרנים והתפוצצות בתרביות המשותפות.
מניסיוננו, תרבית תאי גזע והתמיינות NPC מוקדמת הן הקשות והרגישות ביותר לטעויות טכניות. בשלב זה, אין לבצע את הטכניקות בעקביות ובדיוק עם מרווח קטן לפתרון בעיות. טכניקות התרבית המשותפת המתוארות כאן יכולות לשמש גם במודלים ספציפיים אחרים לסוג התא.
