Este protocolo permite la evaluación en tiempo real de varios procesos y parámetros bioquímicos dentro de la luz de macropinosomas individuales. Estos métodos se pueden emplear para el descubrimiento de fármacos en la biología celular de la macropinocitosis. Este protocolo proporciona la ventaja de revelar heterogeneidad tanto a nivel celular como de orgánulos.
Un día antes del ensayo sembrar células Raw264.7 a una densidad de cinco veces 10 a la potencia de las células en 100 microlitros por pozo, en una placa de 96 pozos con fondo de vidrio con lados negros. El día del ensayo verifique si los pozos son al menos 70% confluentes. Luego lave todos los pozos con 100 microlitros de HBSS, precalentados a 37 grados centígrados.
A continuación, agregue 100 microlitros de HBSS que contengan 0.025 miligramos por mililitro de TMR etiquetados con 70 kilodalton dextrano y 0.025 miligramos por mililitro de fluoresceína etiquetada con 70 kilodalton dextrano en cada pozo, luego incube las células a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Después de completar la incubación, retire la placa de la incubadora y lave las células seis veces con 100 microlitros de HBSS. Después del último lavado, agregue 100 microlitros de HBSS precalentado a las células y luego coloque la placa en un microscopio con una etapa y una cámara calentadas.
Después de ajustar los parámetros de excitación y emisión para TMR y fluoresceína según sea necesario, adquiera una imagen de cada pozo alternando entre los dos fluoróforos entre cada pozo. Después de la primera adquisición, verifique si todos los pozos permanecieron enfocados en toda la placa, luego adquiera imágenes de cada pozo a intervalos de uno a 15 minutos durante el período de tiempo deseado. Durante la adquisición de la imagen, ajuste el pH de una alícuota de 50 mililitros de una solución rica en potasio tamponada con HEPES 25 milimolares a 7.5 usando ácido clorhídrico molar 10 o hidróxido de potasio molar 10 según sea necesario.
Luego ajuste el pH de 350 alícuotas mililitros de la solución rica en potasio tamponada con MES de 25 milimolares a pH 6.5, pH 5.5 y pH 5.0. Una vez que se complete la adquisición de la imagen, retire el HBSS de la placa de 96 pomos que contiene las células y agregue la solución rica en potasio a pH 7.5. Luego agregue nigericina a una concentración final de 10 microgramos por mililitro.
Vuelva a colocar la placa en el microscopio y adquiera imágenes de cada pozo utilizando los mismos ajustes de adquisición que se demostraron anteriormente. Para medir los eventos oxidativos dentro de los macropinosomas, seje las células RAW264.7 en una placa de 96 pozos un día antes del ensayo, como se demostró anteriormente. Luego, el día del ensayo, lave todos los pozos con 100 microlitros de HBSS precalentados a 37 grados centígrados.
A continuación, agregue 100 microlitros de HBSS que contengan 0.025 miligramos por mililitro de TMR etiquetado con 70 kilodalton dextrano y 0.025 miligramos por mililitro de H2DCFDA etiquetado con 70 kilodalton dextrano a cada pozo, luego incube las células a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Después de retirar la placa de la incubadora, lave las células seis veces con 100 microlitros de HBSS. Después del último lavado, agregue 100 microlitros de HBSS a cada pozo y coloque la placa en el microscopio.
Después de ajustar los parámetros de excitación y emisión para TMR y H2DCFDA según sea necesario, adquiera imágenes de cada pozo a intervalos de uno a 15 minutos como se demostró anteriormente. Para medir la digestión de proteínas dentro de los macropinosomas, se siembran células RAW264.7 un día antes del ensayo, como se demostró anteriormente. Luego, el día del ensayo, lave todos los pozos con 100 microlitros de HBSS precalentados a 37 grados centígrados.
A continuación, agregue 100 microlitros de HBSS que contengan 0.025 miligramos por mililitro de TMR etiquetados con 70 kilodalton dextrano en 0.2 miligramos por mililitro bodipy ovoalbúmina etiquetada a cada pomo. Luego incuba la placa a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de retirar las células de la incubadora, lávelas seis veces con 100 microlitros de HBSS.
Después del último lavado, agregue 100 microlitros de HBSS a cada pozo, luego coloque la placa en el microscopio. Después de ajustar los parámetros de excitación y emisión para TMR y BODIPY según sea necesario, adquiera imágenes de cada pozo a intervalos de uno a 15 minutos como se demostró anteriormente. Al medir el pH, los eventos oxidativos o la degradación de proteínas en macropinosomas, la dinámica de la acidificación no se puede medir durante un cierto período de tiempo correspondiente a la fase de carga de dextrano, que varía según el tipo de célula utilizada.
Al medir el pH del macropinosoma, la relación fluoresceína/TMR se hará progresivamente más pequeña y se estabilizará dentro de los 15 minutos de adquisición. Esta meseta corresponde a un pH de aproximadamente cinco, que coincide aproximadamente con el pH de los lisosomas. Al final de cada adquisición, se realiza una calibración in situ.
La relación fluoresceína/TMR debe ser mayor dentro del tampón de calibración a pH 7.5 y volverse progresivamente más pequeña a medida que los tampones de calibración se vuelven más ácidos. Esto permite la generación de una curva de calibración. Al medir los eventos oxidativos dentro de los macropinosomas, la proporción de H2DCFDA a TMR se hará progresivamente mayor y probablemente se estabilizará dentro de los primeros 20 a 30 minutos en una célula RAW264.7 activada.
Al medir la digestión de proteínas macropinosómicas, se liberará una señal de fluoresceína progresivamente fuerte a medida que se digiera la ovoalbúmina. En las células RAW264.7, el aumento de la fluorescencia liberada de la ovoalbúmina digerida etiquetada con BODIPY, se estabilizará en los primeros 30 minutos. Con este papel emergente en la homeostasis y su relevancia recientemente descubierta para la patología del cáncer, actualmente se está llevando a cabo una investigación de macropinocitosis de renacimiento.
Estos métodos se proporcionaron a una caja de herramientas para explorar la contribución de la macropinocitosis a estos campos de estudio.
