Este trabajo fue apoyado por la Fundación Bill y Melinda Gates (Grant 53.085), la Fundación JR Oishei, y la Asociación Americana del Pulmón (Grant RG-123721-N) para APH, y NIH (NIDCD) Becas F31DC011218 a EAC.

1. Preparación de los cultivos bacterianos <ol><li> Creciendo cultura para su uso en experimentos <ol><li> En un bloque de calentamiento de 37 ° C, descongelar una congelados en acciones vial de S. pneumoniae y añadir su contenido a 9 ml de fresco, precalentado caldo de Todd-Hewitt con extracto de levadura al 0,5% (TU) para un volumen total de 10 ml en un tubo de cultivo de vidrio. </li><li> Incubar estáticamente a 37 ° C hasta que el cultivo alcanzó la fase semilogarítmica (600nm Abs ≈ 0,5-0,6). </li></ol></li></ol> 2. La detección de despolarización de la membrana y la Ruptura <ol><li> Reactivos Preparación <ol><li> Preparar un balance de 50 M DiBAC 4 (3) en DMSO al 100% y un mg / ml 2 del PI en ddH 2 O. El DiBAC 4 (3) de valores es estable a -20 ° C durante al menos 6 meses. El stock de PI es estable a 4 ° C durante al menos 6 meses. </li><li> Envuelva las existencias en papel de aluminio para protegerlo de la luz. </li></ol></li><li> Loadingbacterias <ol><li> Sedimentar las células bacterianas de la etapa 1.2.2 por centrifugación a 2400 xg durante 10 min a temperatura ambiente y lavar dos veces por eliminar el sobrenadante, resuspender el precipitado en 10 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se centrifuga de nuevo a 2400 xg durante 10 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en PBS hasta el volumen original. Esto proporcionará aproximadamente 10 8 unidades formadoras de colonias de bacterias por ml. Retire 1 ml (suficiente para 5 muestras) de las células lavadas y colocarlo en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Para estas células, añadir 25 l de una solución 1 M esterilizada por filtración de stock de glucosa (preparado en ddH2O y se filtró a través de un filtro de 0,45 micras) para una concentración final de 25 mM de glucosa, y se incuban en un bloque de calentamiento 37 ° C durante quince minutos. NOTA: Esto proporciona la energía para todos los canales de la membrana dependientes de ATP y componentes celulares. La necesidad de este paso puede variar, dependiendo del experimento. </li><li> Añadir 5 l de la (3) stock 50 mM DiBAC 4 y 10 l de la población de 2 mg / ml PI. Esto proporciona para concentraciones finales de 250 nM y 20 g / ml, respectivamente. Mezcle bien con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces. Añadir 200 l de esta suspensión celular a cada pocillo de muestra de una placa de 96 pocillos clara. </li></ol></li><li> La detección de la fluorescencia <ol><li> Colocar la placa en un (37 ° C) lector de placas de detección de fluorescencia precalentado. </li><li> Asegúrese de que los filtros adecuados estén en su lugar para DiBAC 4 (3) (490 nm de excitación, 516 nm de emisión) y PI (535 nm de excitación, 617 nm de emisión) de detección. </li><li> Para tener en cuenta (y al mismo tiempo vigilar) equilibrio de DiBAC 4 (3) a través de la membrana, establezca el lector a tomar medidas de fluorescencia cada minuto durante aproximadamente 30-40 minutos, o hasta que la lectura se estabilice, lo que sirve como una lectura &quot;pretratamiento&quot;. </li><li> Expulsar plato y añadir el agente experimental de elección y immedcolocar iately la placa posterior en el lector para continuar el seguimiento de DiBAC 4 (3) y la fluorescencia PI para el período de tiempo deseado. Si el tratamiento de varias muestras a la vez, usando una pipeta multicanal puede ser útil añadir el agente de forma simultánea a todos los pocillos. </li><li> Exportar las lecturas a un programa de análisis de datos, como Microsoft Excel. Parcela fluorescencia con el tiempo para evaluar despolarización de la membrana y ruptura. El aumento de la fluorescencia de DiBAC y PI indica que la despolarización y la ruptura se están produciendo. </li></ol></li></ol> 3. Detectar cambios en intracelulares de Ca 2 + o K + Concentraciones <ol><li> Preparar reactivos y tampón de carga <ol><li> Preparar los siguientes reactivos: 5 mM de stock del tinte fluorescente sensible a iones (fura-2/AM o PBFI / AM; añadir la cantidad apropiada de DMSO a un tubo que contiene 50 g del colorante), &quot;100x&quot; probenecid (añadir 1 ml de PBS a un vial de 77 mg). El solubilizadocolorantes pueden congelarse a -20 ° C una vez y son estables en solución durante 3 meses, mientras que el probenecid es estable en solución a -20 ° C durante 6 meses. </li><li> Preparar 1 ml de 2x tampón de carga de la siguiente manera: En la parte inferior de un tubo cónico de plástico de 15 ml, dispensar 20 l de 100x PowerLoad concentrado (estables a 2-8 ° C durante 6 meses), seguido de 2 l de 5 mM de ion sensibles de tinte directamente en el PowerLoad. Vortex brevemente para mezclar. Añadir 960 l de PBS seguido de 20 l de 100x probenecid. Agite la mezcla por última vez. Envuelva en papel de aluminio para protegerlo de la luz. </li></ol></li><li> Colocación de las bacterias con el tinte <ol><li> Se precipitan y se lava el cultivo bacteriano en fase logarítmica media como se describe en 2.2.1. Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en 5 ml de PBS para hacer una &quot;2x&quot; suspensión celular. </li><li> Añadir 1 ml de la suspensión celular a la 2x 2x tampón de carga de. Esto proporcionará para un volumen final de 2 ml, y Concentr definitivaciones de 1x PowerLoad, 5 mM colorante fluorescente, y 1x probenecid. NOTA: Esta suspensión proporciona un volumen suficiente para 10 muestras desde cada pocillo de la muestra para la medición contendrá 200 l. </li><li> Incubar en un 37 ° C baño de agua durante 75 min, protegido de la luz. NOTA: El colorante se carga en las células bacterianas en ausencia de cualquier sustratos glicolíticas y en presencia de probenecid para reducir al mínimo flujo de salida del colorante. </li><li> LAVADO 1: sedimentar las células por centrifugación a 2400 xg durante 10 min, eliminar el sobrenadante, y se resuspende en 2 ml de PBS que contenía probenecid 1x. LAVADO 2, 3: Repita el paso 3.2.4 2x. Incubar a 37 ° C durante otros 30 min. Esto le dará tiempo para esterasas bacterianas para hidrolizar el grupo éster AM lejos de los tintes fluorescentes internalizados. </li><li> LAVADO 4: sedimentar las células por centrifugación a 2400 xg durante 10 min, eliminar el sobrenadante, y se resuspende en 2 ml de PBS que contenía probenecid 1x. NOTA: Dependiendo del experiment, la glucosa se puede agregar de nuevo aquí para revitalizar las bacterias. </li></ol></li><li> La detección de la fluorescencia <ol><li> Precalentar la detección por fluorescencia lector de placas de lector de placas a 37 ° C. </li><li> Para cada muestra se desea, añadir 200 l de las células cargadas (de la etapa 3.2.8) a los pocillos de una placa de 96 pocillos. (Lleve a cabo los siguientes pasos para la finalización de un pozo / muestra a la vez). </li><li> Establecer una línea de base para la lectura de un pozo, lugar de placa en la detección de fluorescencia lector de placas para medir la fluorescencia (340 nm de excitación / emisión de 510 nm para &quot;Valor 1&quot; y 380 nm de excitación / emisión de 510 nm para &quot;Valor 2&quot;) en cada segundo durante un minuto. </li><li> Expulsar plato, añadir el tratamiento de elección para que así (en un pequeño volumen de aproximadamente 5 l), pipetear rápidamente arriba y abajo varias veces para mezclar y colocar inmediatamente de nuevo en la detección de fluorescencia lector de placas para leer cada segundo durante deseada longitud de tiempo. (Si el eninyectores asociados con el lector de placas están disponibles, estos también podrían utilizarse para añadir a la perfección el tratamiento deseado, la eliminación de la necesidad de detener la lectura y expulsar la placa). </li><li> Exportar las lecturas a un programa de análisis de datos, como Microsoft Excel. Calcular la relación entre los valores de fluorescencia para cada punto de tiempo dividiendo Valor 1 Valor por 2, y representar los valores de la relación en un gráfico. </li></ol></li></ol> 4. Detectar cambios en el pH intracelular <ol><li> Preparar reactivos y tampones de calibración <ol><li> Prepare los siguientes reactivos: mM almacén 5 de BCECF / AM (. Añadir la cantidad apropiada de DMSO a un tubo que contiene 50 g del colorante Esta población es estable a -20 ° C durante 3 meses); 100x probenecid (añadir 1 ml de PBS a un vial de 77 mg);. 1 mM de preparación de stock de nigericina en etanol (requerido para equilibrar el pH intracelular (pH i) de las células a la pH del tampón circundante Esta acción es stabla a -20 ° C durante 6 meses);. mM del carbonilo cianuro de 3 clorofenilhidrazona (CCCP) en DMSO (protonóforo para desacoplar la fuerza motriz de protones 0,5 Esta población es estable a -20 ° C durante 6 meses) </li><li> Prepare 10 ml de los siguientes tampones altos de potasio: NaOH 135 mM KH 2 PO 4/20 mM (monobásico) y 110 mM K 2 HPO mM NaOH 4/20 (dibásico). Filtro de esterilizar utilizando un filtro de 0,45 micras. (Estos tampones se pueden almacenar a 4 ° C hasta su uso). </li><li> Mezclar los buffers altos de potasio en la proporción necesaria para crear buffers altos de potasio con al menos 5-6 valores de pH comprendidos entre 6,5 y 8,0. </li><li> Preparar 1 ml de 2x tampón de carga de la siguiente manera: En la parte inferior de un tubo cónico de plástico de 15 ml, dispensar 40 l de 100x PowerLoad, seguido por 20 l de colorante sensible a iones, 5 mM directamente en el PowerLoad. Vortex brevemente para mezclar. Añadir 900 l de PBS seguido de 40 l de 100x probenecid. Vortex la mezcla por última vez. Envuelva en papel de aluminio para protegerlo de la luz. </li></ol></li><li> Colocación de las bacterias con el tinte <ol><li> Pellet y lavar las 8 ml del cultivo bacteriano fase semilogarítmica como se describe en el punto 2.2.1. Aspirar el sobrenadante, resuspender pellet en 2 ml de PBS para hacer una &quot;4x&quot; suspensión celular. </li><li> Añadir 1 ml de la suspensión celular 4x a la 2x tampón de carga de. Esto proporcionará para un volumen final de 2 ml, y concentraciones finales de las células 2x, 2x PowerLoad, 50 mM colorante fluorescente, y 2x probenecid. </li><li> Incubar en un 30 ° C baño de agua durante 40 min, protegido de la luz. NOTA: El colorante se carga en las células bacterianas a la temperatura inferior de 30 ° C y en ausencia de cualquier sustratos glicolíticas para reducir al mínimo flujo de salida del colorante. </li><li> WASH 1: Pellet las células por centrifugación a 2400 xg durante 10 minutos, retire el sobrenadante para eliminar el exceso de tinte, y resuspender en 4 ml de PBS que contenía 2x probenecid unglucosa o 1 mM (para revitalizar las bacterias). LAVADO 2, 3: Repetir el paso 4.2.7 dos veces, con resuspensión final en 4 ml de PBS (para una concentración final de células de 1x) que contiene probenecid 2x y glucosa 10 mM. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 5 min. Esto permitirá que las células se energizan completamente y permiten tiempo para esterasas bacterianas para escindir el grupo éster de AM alejada del BCECF internalizado. </li></ol></li><li> El establecimiento de la fluorescencia de fondo y en la curva de calibración in vivo <ol><li> Precalentar la detección por fluorescencia lector de placas de lector de placas a 37 ° C. </li><li> Para determinar la fluorescencia de fondo, filtro-esterilizar aproximadamente 500 l de la suspensión bacteriana cargado y lleno de energía (de la etapa 4.2.7) para eliminar las bacterias, y añadir 200 l de filtrado para el pocillo de la placa de 96 pocillos. </li><li> Coloque la placa en la detección de fluorescencia lector de placas para medir la fluorescencia (490 nm de excitación / emisión de 530 nm para&quot;Valor 1&quot; y 440 nm de excitación / emisión de 530 nm para &quot;Valor 2&quot;) durante 1 min. Esta fluorescencia de fondo se debe restar antes del cálculo de los ratios, tanto para la curva de calibración y las muestras experimentales. </li><li> Para obtener una curva de calibración in vivo, lavar 500 ml de alícuotas de las células cargadas y con energía procedente de la etapa 4.2.7 una vez y resuspender en tampones altos de potasio a diferentes valores de pH (que van desde 6,5 hasta 8,0). </li><li> Añadir 20 M nigericina a las muestras para equilibrar el pH intracelular de las células para el pH del tampón circundante y se incuba a 37 ° C durante 5 min. Añadir 200 l de combinaciones de tampones bacterias / pH a los pocillos de una placa de 96 pocillos. </li><li> Coloque la placa en la detección de fluorescencia lector de placas para medir la fluorescencia durante unos minutos para establecer una lectura constante para cada pozo. Exportar las lecturas a un programa de análisis de datos, como Microsoft Excel. </li><li> Después de restar la bavalores de fluorescencia ckground, calcular la relación de los valores de fluorescencia por dividir el valor 1 por valor 2. Grafica los valores de la relación de cada tampón de pH para crear la curva de calibración. (Una curva de calibración debe ser generado para cada nuevo lote de células cargadas, como la cantidad de colorante fluorescente que se carga en las bacterias puede variar cada vez). </li></ol></li><li> Medición de los cambios en el pH intracelular <ol><li> Para cada muestra se desea, añadir 200 l de las células cargadas y energizadas (desde el paso 4.2.7) a los pocillos de una placa de 96 pocillos. </li><li> Coloque la placa en la detección de fluorescencia lector de placas y medir la fluorescencia de las muestras cada 5 s durante 5 min. </li><li> Extraiga el plato y añadir 10 mM CCCP a un pocillo (sirve como control positivo de la disminución del pH intracelular) y el agente experimental (s) de interés para los demás pozos. Para comparar con precisión sus efectos en el tiempo, añadir el CCCP y agentes de elección al mismo tiempo utilizando ampipeta ultichannel. </li><li> Devolver inmediatamente la placa al lector de placas y continuar midiendo la fluorescencia de cada 5 s durante 10 min. Como un control adicional, expulse la placa y añadir 20 mM Nigericina a todas las muestras para equilibrar el pH i de las bacterias al pH del tampón circundante, y leer durante 5 min. </li><li> Después de restar los valores de fluorescencia de fondo, calcular los cocientes de fluorescencia para cada muestra. Interpolar el pH i para cada lectura de la curva de calibración. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen intereses financieros en competencia para declarar.

A pesar de la limitación de que el tamaño presenta para el uso de métodos clásicos de electrofisiología para detectar cambios en la polaridad y la integridad de la membrana y los cambios en las concentraciones de iones dentro de las bacterias, hemos descrito una forma de medir estos eventos en S. pneumoniae usando colorantes fluorescentes. Nuestros protocolos son los primeros de su tipo descrito para el neumococo y uno de los pocos que se ha descrito para especies bacterianas en general. Mediante el uso de...

Nuestro laboratorio ha identificado un complejo de lípido-proteína de la leche humana llamada Hamlet (para la alfa-lactoalbúmina Hecho letal para las células tumorales) que induce la apoptosis en las células tumorales, sino que también es capaz de matar a una variedad de especies bacterianas 1,2. Las especies que se han encontrado para ser particularmente sensibles fueron aquellos que se dirigen a las vías respiratorias, con Streptococcus pneumoniae (neumococo) que muestra la mayor sensibilidad y un fenotipo de apoptosis como de la muerte 2,3. Eventos de transporte despolarización de la membrana y de iones específicos son bien descritos y acontecimientos cruciales durante la apoptosis en células eucariotas, en particular en las mitocondrias, donde se han utilizado radiactivos TPP + iones y colorantes fluorescentes como JC-1 y TMRE para demostrar la despolarización de la membrana mitocondrial 3 -5. Por lo tanto, tratamos de obtener más información sobre el efecto de la aldea en estas funciones relacionadas con la membrana en el neumococo como nos hemos centrado nuestros esfuerzos paradesarrollar una mejor comprensión de los componentes mecánicos del fenotipo de la apoptosis como en las bacterias, con un gran potencial para la identificación de nuevas terapias antibacterianas o vacunas candidatas en el proceso. Al tratar de establecer protocolos para nuestros estudios sobre el mecanismo, hemos descubierto que, en contraste con la metodología bien descrita en los sistemas eucariotas, existen muy pocos estudios publicados que detallan los mecanismos de electrofisiología y de transporte de iones del 6,7 membrana bacteriana. Esto se atribuye principalmente al menor tamaño de los microorganismos y su arquitectura de la superficie, en particular la presencia de la pared celular, que restringe la accesibilidad de la membrana para el uso de métodos convencionales como eucariotas patch clamp, aunque algunos estudios utilizando protoplastos gigantes se han realizado con éxito mixto 8,9. Como el trabajo con estos protoplastos gigantes no es un método ideal o incluso práctico para la mayoría de especies bacterianas, ya que requiere que el hombrebacterias ipulated en un estado antinatural y abiótico, los estudios limitados de la polaridad de la membrana bacteriana que se han realizado han empleado principalmente citometría de flujo y el uso de cianina y oxonol colorantes fluorescentes 10-16. En lugar de la citometría de flujo, que recoge lecturas de fluorescencia individuales de una bacteria a un solo punto de tiempo, se optó por utilizar un lector de placas de detección de fluorescencia para detectar la intensidad de fluorescencia de las suspensiones bacterianas en un formato de placa de 96 pocillos con el tiempo. Esto nos permitió para tratar una población de bacterias en diversos puntos temporales con mucha mayor simplicidad y facilidad, y supervisar continuamente la cinética de fluorescencia de toda la población durante largos períodos de tiempo, lo cual es difícil de lograr usando citometría de flujo. Después de probar una amplia variedad de los colorantes fluorescentes de potencial sensible (incluyendo los mencionados anteriormente para su uso con la mitocondria), hemos logrado el mejor éxito técnico y práctico utilizando latinte bis-oxonol llamado DiBAC 4 (3) (bis-(ácido 1,3-dibutylbarbituric) oxonol trimetina) para monitorear los cambios en la polaridad. También nos pareció valioso para supervisar simultáneamente las interrupciones en la integridad de la membrana utilizando yoduro de propidio (PI). Este colorante emite fluorescencia al unirse al ácido nucleico, pero sólo es capaz de hacerlo cuando está en peligro la integridad de la membrana bacteriana, por lo que es el componente popular que se usa para detectar células muertas en los ensayos de tinción vivos muertos. Además de PI, SYTOX verde y TO-PRO-1 son colorantes fluorescentes que son similares en la acción y se han utilizado previamente para las bacterias en unos pocos estudios de citometría de flujo utilizando métodos de detección 17. Hemos elegido utilizar PI debido a su longitud de onda de excitación que nos permitió monitorear su fluorescencia simultáneamente con DiBAC en una muestra dada. En nuestros estudios, hemos observado que Hamlet, así como otro complejo lípido-proteína relacionada con la actividad bactericidaconocido como ELOA, la despolarización inducida y de la ruptura de la membrana bacteriana como se indica por el aumento de la fluorescencia de ambos colorantes tras el tratamiento de los neumococos 3,18,26. Para ambos complejos, se observó que la intensidad de fluorescencia de DiBAC 4 (3) aumentó antes del aumento en la intensidad de la PI, lo que indica que la despolarización se produjo antes de la ruptura y es, por lo tanto, un evento específico inducido por nuestros complejos lípido-proteína de bactericidas interés. Esta distinción es importante hacer, como la ruptura de la membrana puede causar en sí despolarización inespecífica. Cinética de la medición y análisis tanto DiBAC 4 (3) y de fluorescencia PI simultáneamente nos permitió examinar esta relación entre los dos eventos de membrana, lo cual es una ventaja adicional del uso de fluorometría lugar de la citometría de flujo. Para controlar el flujo de iones bacteriana, ha habido cierto éxito anterior con el uso de radioisótopos, incluyendo la medición de la absorción de45 Ca 2 + en el neumococo 19,20, lo que también hemos utilizado en nuestros estudios recientes 18, 21. Sin embargo, el trabajo con estos iones radiactivos tiene varios inconvenientes. Pueden ser costoso, consume tiempo, y desordenado, y también puede exponer a la persona que realiza el experimento para dañar, dependiendo del isótopo de interés. Además, es difícil controlar los cambios rápidos en el tiempo. Por lo tanto, se volvió hacia un método alternativo de medición que emplea versiones acetoximetilo (AM) de éster de indicador fluorescente colorantes sensibles a iones. Por sí mismo, el colorante indicador está cargado y no pasa a través de la membrana fácilmente, pero con la adición del grupo éster lipófilo, la molécula no cargada ahora puede pasar a través de la membrana de la bacteria. Al entrar en el interior, las esterasas bacterianas escindir el grupo éster, dejando el colorante libre dentro de la célula y otra vez cargada, ralentizando significativamente su capacidad para salir de la celda y permitir que el tinte to se acumulan en el interior a través del tiempo. Sin embargo, el uso de estos colorantes de éster sólo se ha descrito en unas pocas especies bacterianas para detectar cambios en el Ca2 + intracelular 22-24 y H + 16, con diferentes métodos de carga, la detección, y el éxito. Con el deseo de controlar los cambios en intracelulares de Ca 2 + y también los niveles de K + y H + en S. pneumoniae tras el tratamiento con Hamlet y otros compuestos, que creado con éxito protocolos para cargar de manera eficiente colorantes indicadores fluorescentes en las células bacterianas. Carga eficaz en bacterias necesarias tanto probenecid que aumenta la retención de colorante mediante el bloqueo de los transportadores aniónicos y PowerLoad, un compuesto patentado de Life Technologies que aumenta la eficiencia de carga. Fura-2/AM (detección de Ca 2 +), PBFI / AM (detección de K +), y BCECF / AM (detección de H +) se cargaron con éxito en tanto no encapsulado y encapsulado neumocócica stlluvias que permiten la medición de los patrones de fluorescencia resultantes después de la adición de ionóforos, tales como ionomicina (Ca 2 + desacoplador), valinomicina (K + desacoplador) y CCCP (H + desacoplador) usando un lector de placas de detección de fluorescencia 18, 21.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="864">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Todd Hewitt</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">249240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:139px;">Bacto, BD Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5879</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4170</td>
			<td>Make up in deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PowerLoad</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P10020</td>
			<td>100X concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Probenecid</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P36400</td>
			<td>Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Fura-2/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">F1221</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBFI/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">P1267</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Nigericin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">3246-01</td>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">4012-01</td>
			<td>dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">NaOH</td>
			<td style="width:139px;">JT Baker</td>
			<td style="width:143px;">5565-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BCECF/AM</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:143px;">B1170</td>
			<td>Special packaging (50 &#181;g aliquots)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">CCCP</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;dissipating the electrical potential and the H+ gradient.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Culture tube&#160;</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">53283-802</td>
			<td>Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Spectronic 20D+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">15 ml plastic conical tube</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Clear 96-well polystyrene microtiter plate</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">12-565-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Plate reader</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Synergy 2 Multi-Mode&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:143px;">Microplate Reader</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:359px;">Gen5 software</td>
			<td style="width:139px;">BioTek</td>
			<td style="width:143px;">Gen5&#8482; Software</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring changes in membrane polarity, membrane integrity, and intracellular ion concentrations in streptococcus pneumoniae using fluorescent dyes

Despolarización de la membrana y de iones flujos son eventos que han sido estudiados ampliamente en los sistemas biológicos debido a su capacidad para afectar profundamente las funciones celulares, incluyendo la energética y transducciones de señal. Aunque ambos métodos fluorescentes y electrofisiológicos, que incluyen el uso de electrodo y el parche de sujeción-, han sido bien desarrollado para la medición de estos eventos en células eucariotas, la metodología para la medición de eventos similares en microorganismos han demostrado ser más difícil de desarrollar dado su pequeño tamaño en combinación con el más complejo la superficie externa de las bacterias de blindaje de la membrana. Durante nuestros estudios de la muerte a la iniciación en el Streptococcus pneumoniae (neumococo), hemos querido dilucidar el papel de los eventos de membrana, incluidos los cambios en la polaridad, la integridad, y las concentraciones de iones intracelulares. Buscando en la literatura, encontramos que existen muy pocos estudios. Otros investigadores habían supervisado la captación de radioisótopos o de equilibrio para medir la gripe ionxes y potencial de membrana y un número limitado de estudios, en su mayoría en los organismos Gram-negativos, habían visto un cierto éxito utilizando carbocianina o oxonol tintes fluorescentes para medir el potencial de membrana, o la carga de bacterias con acetoximetil-célula permeable (AM) versiones de ésteres de sensible a los iones colorantes indicadores fluorescentes. Por lo tanto, establecimos y optimizado los protocolos para medir el potencial de membrana, ruptura, y el transporte de iones en el organismo Gram-positiva S. pneumoniae. Hemos desarrollado protocolos utilizando el colorante de bis-oxonol DiBAC 4 (3) y el yoduro de propidio tinte-células impermeable para medir la despolarización de la membrana y ruptura, respectivamente, así como los métodos para cargar de manera óptima los neumococos con los ésteres de AM de los colorantes ratiometric Fura-2, PBFI, y BCECF para detectar cambios en las concentraciones intracelulares de Ca 2 +, K +, y H +, respectivamente, utilizando un lector de placas de detección de fluorescencia. Estos protocolos son los primeros de su tipo para el neumococoy la mayoría de estos tintes no se han utilizado en otras especies bacterianas. Aunque nuestros protocolos han sido optimizados para S. pneumoniae, creemos que estos enfoques deben ser un excelente punto de partida para estudios similares en otras especies bacterianas.

Para todos los experimentos, hay una muestra y conjunto de condiciones presentes en cada pocillo. Por lo tanto, cada rastreo representa la intensidad de fluorescencia de toda una población de bacterias en el tiempo. Los resultados deben ser fácilmente interpretables, con una clara distinción entre la fluorescencia de las muestras tratadas y la de los controles no tratados. La cinética y el grado de un cambio observado en la fluorescencia podrían proporcionar información sobre el posible mecanismo y la mag...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes at JoVE.c

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

A diferencia de la observada para eucariotas, hay una escasez de estudios que despolarización detalle de la membrana y la concentración de iones cambios en las bacterias, principalmente como su pequeño tamaño hace que los métodos convencionales de medición de difícil. En este sentido, los protocolos de detalle para el seguimiento de estos eventos en el Gram-positivas patógeno significativo Streptococcus pneumoniae utilizando técnicas de fluorescencia.

Vigilar los cambios en la polaridad de la membrana, membrana Integridad, e intracelular de iones concentraciones en<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Uso de tintes fluorescentes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

monitoring-changes-membrane-polarity-membrane-integrity-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

13.5K vistas.  University at Buffalo, State University of New York.  A diferencia de la observada para eucariotas, hay una escasez de estudios que despolarización detalle de la membrana y la concentración de iones cambios en las bacterias, principalmente como su pequeño tamaño hace que los métodos convencionales de medición de difícil. En este sentido, los protocolos de detalle para el seguimiento de estos eventos en el Gram-positivas patógeno significativo Streptococcus pneumoniae utilizando técnicas de fluorescencia. 

Video: Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Capsular serotipificación de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Uso de la Reacción Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

Capsular Serotipificación de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Por partículas de látex

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Antibody Labeling with Fluorescent Dyes Using Magnetic Protein A and Protein G Beads

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, immunodiagnostics and more recently as therapeutic agents. Traditional methods for labeling antibodies with small molecules require purified antibodies at relatively high concentration, involve multiple dialysis steps and have limited throughput. However, several applications, including the field of Antibody Drug Conjugates (ADCs), will benefit from new methods that will allow labeling of antibodies directly from cell media. Such methods may allow antibodies to be screened in biologically relevant assays, for example, the receptor-mediated antibody internalization assay in the case of ADCs. Here, we describe a method (on-bead method) that enables labeling of small amounts of antibodies directly from cell media. This approach utilizes high capacity magnetic Protein A and Protein G affinity beads to capture antibodies from the cell media followed by labeling with small molecules using either amine or thiol chemistry and subsequent elution of the labeled antibodies. Taking fluorescent dyes as surrogates for small molecules, we demonstrate the on-bead labeling of three different mouse antibodies directly from cell media using both amine and thiol labeling chemistry. The high binding affinity of antibodies to Protein A and Protein G ensures high recoveries as well as high purity of the labeled antibodies. In addition, use of magnetic beads allows multiple samples to be handled manually, thereby significantly improving labeling throughput.

The on-bead method for labeling antibodies with small molecules enables labeling of a small amount of antibodies directly from cell media. This method is compatible with amine and thiol chemistry, and can handle multiple samples in parallel, manually or using automated platforms.

Antibody Labeling con tintes fluorescentes utilizando proteína magnética A y Proteína G cuentas

Antibodies labeled with small molecules like fluorescent dyes, cytotoxic drugs, and radioactive tracers are essential tools in biomedical research, ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I molecules also known as cross-presentation (CP). CP plays an important role not only in the stimulation of na&#239;ve CD8+ T cells and memory CD8+ T cells for infectious and tumor immunity but also in the inactivation of self-acting na&#239;ve T cells by T cell anergy or T cell deletion. Although the critical molecular mechanism of CP remains to be elucidated, accumulating evidence indicates that exogenous antigens are processed through endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) after export from non-classical endocytic compartments. Until recently, characterizations of these endocytic compartments were limited because there were no specific molecular markers other than exogenous antigens. The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of these endocytic compartments. Using this purified microsome, we reconstituted the ERAD-like transport, ubiquitination, and processing of the exogenous antigen in vitro, suggesting that the ubiquitin-proteasome system processed the exogenous antigen after export from this cellular compartment. This protocol can be further applied to other cell types to clarify the molecular mechanism of CP.

The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of the cellular compartments where exogenous antigens are processed by endoplasmic reticulum-associated degradation in cross-presentation.

Purificación del compartimento de la membrana de retículo endoplasmático asociado degradación de antígenos exógenos en presentación cruzada

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

Ensayo de reparación de membrana de la célula utilizando un microscopio de dos fotones láser

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...