La medición de la frecuencia cardíaca intrínseca es un indicador importante de la salud cardíaca. Esta técnica mide con precisión esta tasa mientras excluye la mayoría de las influencias de confusión en el nódulo sinoauricular. El registro MEA de la frecuencia cardíaca intrínseca captura datos precisos de la velocidad de disparo similares a los registros de una sola célula sin un entrenamiento electrofisiológico extenso.
Las personas que usan esta técnica pueden tener dificultades para obtener preparaciones de tejido sano en los primeros experimentos, así que practique la disección y optimice los búferes y la configuración de recopilación de datos antes de comenzar la recopilación de datos reales. Demostrando el procedimiento estarán los doctores Man Si y Praveen Kumar, investigadores postdoctorales en mi laboratorio. Comience sosteniendo la piel del ratón eutanasiado con un hemostático y use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión transversal en la piel justo debajo de la parte inferior de la caja torácica desde el arco costal izquierdo hasta el arco costal derecho.
Use tijeras quirúrgicas para abrir el peritoneo y separe cuidadosamente el hígado del diafragma sin cortar el hígado para evitar el sangrado excesivo. Incite el diafragma a lo largo del tórax para exponer la cavidad torácica. Use las tijeras quirúrgicas para cortar las paredes laterales de la caja torácica desde los bordes de los arcos costales hasta las clavículas para exponer el corazón, luego use una aguja de jeringa de calibre 23 para fijar la caja torácica sobre el hombro.
Use una pipeta de transferencia para dejar caer la solución completa de Tyrode heparinizada caliente sobre el corazón para mantenerlo húmedo. Sostenga los pulmones con pórceps Graefe extra finos y arte la tráquea con tijeras quirúrgicas para extirpar los pulmones. Para extraer el corazón, sostenga el ápice del corazón con pórceps Graefe extra finos y corte la aorta y la vena cava inferior con tijeras quirúrgicas.
Transfiera el corazón a una placa de Petri que contenga elastómero de silicona curado y use una pipeta de transferencia para bañar el corazón con dos o tres mililitros de solución completa de Tyrode heparinizada caliente. Conecte el ápice del corazón al plato con un pasador de disección. Sostenga la vena cava inferior con las pórceps de laminectomía Dumont 2.
Inserte una aguja de jeringa de calibre 22 a través de la vena cava inferior y superior para ubicar su posición en la aurícula derecha, que también identifica la posición aproximada del nódulo sinoauricular. Sostenga el apéndice auricular derecho con pinzas de laminectomía Dumont 2 y coloque un pasador de disección a través del apéndice auricular derecho para mantenerlo en su lugar. Repita el mismo procedimiento para el apéndice auricular izquierdo y, a continuación, retire la aguja de la jeringa que abarca la vena cava.
Use tijeras Castroviejo para eliminar el ápice del corazón haciendo una incisión transversal a través de los ventrículos para liberar la sangre del corazón, luego lave el corazón agregando una solución completa de Tyrode heparinizada caliente. Use tijeras Castroviejo para cortar a lo largo del tabique auriculoventricular hasta que las aurículas se separen de los ventrículos y mantengan la incisión más cerca del ventrículo. Corte a lo largo del tabique interarterial para eliminar la aurícula izquierda.
Coloque los pasadores de disección en la periferia de la aurícula derecha para que que queden planos. Retire cualquier resto de grasa, vasos o tejido de la aurícula con las tijeras Castroviejo y localice el nódulo sinoauricular en la aurícula derecha. Agregue la solución de Tyrode al modelo de solución de entrada y active el flujo de gas carbógeno para oxigenar la solución de Tyrode.
Configure la bomba peristáltica a 25 RPM, lo que da un caudal de dos mililitros por minuto. Después de arrancar la bomba, asegúrese de que el amortiguador no tenga fugas del sistema y ajuste el controlador de temperatura a 37 grados centígrados. Utilice las pórceps Dumont 55 para transferir el tejido diseccionado de la placa de Petri de disección a la rejilla de matriz de microelectrodos.
Coloque suavemente el tejido con un pincel suave para superponer la región del nódulo sinoauricular de la rejilla del electrodo. Luego coloque la malla sobre el tejido usando las pórceps óseas o cualquier pórceps curvo. Usando las forrzas óseas, coloque el ancla del arpa en la malla para mantener todo en su lugar.
Coloque el plato de matriz de microelectrodos en la placa conectora. Coloque cuidadosamente la tapa de perfusión en el plato de matriz de microelectrodos sin perturbar el anclaje de la rodaja de arpa y asegure el espacio de perfusión con cinta adhesiva. Encienda el amplificador y configure un flujo de trabajo para la grabación en el software.
Seleccione beat_recording. plantilla moflo. Ábralo y establezca el número de trazas, la duración de la traza, el intervalo de traza, el voltaje de entrada, la frecuencia de muestreo y otros parámetros de grabación de acuerdo con las condiciones de grabación deseadas.
Haga clic en el botón de grabación y reproducción para iniciar la grabación y adquirir datos para 10 trazas de un minuto de duración con dos minutos de intervalos entre las trazas. Detenga la bomba y cambie el tubo de entrada de la bomba de la solución de grabación normal a la solución de Tyrode que contiene el medicamento deseado de su elección. Reinicie la bomba y reanude la grabación.
Una vez que la solución de Tyrode con infusión de fármaco haya llegado al tejido, registre 10 trazas de la misma manera que se hizo anteriormente para los registros de referencia. Tome una imagen final del posicionamiento del tejido en la matriz de microelectrodos. Abra el archivo de datos grabados guardados en la plantilla de análisis de frecuencia de latido del software de análisis.
Haga clic en la reproducción y permita que se ejecute toda la grabación para la visualización de datos y luego asigne los parámetros de análisis apropiados. Seleccione los canales que se incluirán en el análisis y establezca los valores máximos de amplitud o umbral de amplitud mínima deseados para la identificación automatizada del pico de la forma de onda. Haga clic de nuevo en el icono de reproducción para volver a ejecutar el conjunto de datos y confirmar que los parámetros de análisis son adecuados para una extracción de picos.
Para el análisis, identifique los tres rastros consecutivos más estables que exhiben una tasa de latido estable para cada rastro en la mayoría de los canales durante el período de referencia del experimento y otros tres rastros estables consecutivos durante el período de exposición al medicamento. Haga clic en el icono de reproducción y grabación para iniciar el análisis. Los datos se recopilaron de un ratón suizo negro macho de tipo salvaje de 45 días de edad para la medición de la frecuencia de latido del nodo sinoauricular.
Las formas de onda con diferentes formas y amplitudes se observaron en diferentes canales y todos los canales mostraron intervalos de intercalación idénticos y frecuencias de disparo. Sin embargo, el grado de contacto del tejido con el electrodo también puede influir en las características de la forma de onda, como la amplitud. De las 10 trazas registradas, se eligieron los tres canales consecutivos con frecuencia de latido estable e intervalo entre canales para un análisis posterior.
Los malos patrones de picos extraídos deben estar ausentes, pero si están presentes están influenciados por el ruido o son inestables. Las formas de onda que corresponden a los latidos cardíacos individuales reflejan la actividad intrínseca de marcapasos cardíacos. El sistema de matriz de microelectrodos permite una fácil aplicación de agentes farmacológicos para analizar los efectos farmacológicos.
Se encontró que la velocidad de disparo intrínseca de tres trazas seleccionadas en los 64 canales era de aproximadamente 320 latidos por minuto en los datos de muestreo. La introducción de 4-aminopirimidina aumentó los intervalos entre intervalos como se esperaba, lo que disminuyó la frecuencia de latido de 320 a 210 latidos por minuto. Para recopilar datos confiables para el análisis, es importante confirmar que el tejido está sano durante el registro verificando que los rastros sean estables y cumplan con los criterios estándar.
Los AMUMA se pueden utilizar para registrar la actividad cardíaca en otras regiones del corazón, lo que permite una caracterización detallada específica de la región que es susceptible de estudiar los efectos de la manipulación genética y farmacológica.
