Este protocolo proporciona un método alternativo in vivo para estudiar el papel de crecimiento tumoral de un knockout de genes letal embrionario. La ventaja de este método es que los knockouts de genes que normalmente son letales embrionarios se pueden realizar en tumores derivados de un modelo de ratón genéticamente modificado para estudiar sus efectos de pérdida de función in vivo. Esta técnica se puede aplicar a enfermedades que requieren estudiar el papel in vivo de genes esenciales embrionarios inalcanzables de los modelos tradicionales de ratones knockout de genes.
La generación del modelo animal lleva tiempo y se requieren pruebas empíricas para determinar el MOI óptimo para la infección adenoviral para garantizar que se logre la recombinación adecuada. Para empezar, identifique el ratón con el genotipo deseado. Cuando un ratón portador de tumor alcanza su punto final humanitario, eutanasia al ratón y use un cuchillo de bisturí estéril para extirpar el tumor.
Diseccionar el tumor en tres secciones en cortes estilo pan de pan usando un cuchillo de bisturí para generar los segmentos de tejido para la fijación de formalina parafina incrustando la generación temprana de cultivos de paso y la congelación instantánea para análisis analíticos. Tinción de una sección de tejido fijada en parafina fija en formalina de cinco micrómetros de espesor con hematoxilina y eosina. Una vez que un patólogo confirma el tumor, realice la tinción inmunohistoquímica para confirmar el diagnóstico del tumor.
Coloque el tejido tumoral maligno de la vaina nerviosa periférica recién recolectado en 10 mililitros de PBS estéril helado sobre hielo, y luego transfiéralo a un área de trabajo estéril para establecer cultivos de paso temprano. Picar el tejido tumoral en pedazos de dos a cuatro milímetros y triturar de ocho a 10 veces en una placa de cultivo de tejido tratada de 10 centímetros cuadrados que contenga 10 mililitros de medio de crecimiento. Cultive estos tejidos en medio de crecimiento DMEM-10 de alta glucosa suplementado con 10 nanomolares de neuregulina-1 beta y dos forskolina micromolar.
Sembrar las células tumorales de paso temprano a una densidad de 1.5 veces 10 a las sextas células por un plato de cultivo de tejido tratado de 10 centímetros cuadrados que contenga medio de crecimiento DMEM-10. Después de 12 a 16 horas, lave los cultivos adherentes con dos a cuatro mililitros de DPBS e infecte las células con adenovirus a aproximadamente 400 unidades formadoras de placa por célula en 10 mililitros de DMEM sin suero. Después de 48 horas de la infección, verifique brevemente las células en busca de señal de EGFP en un microscopio de fluorescencia para garantizar una infección eficiente con aproximadamente 50 a 100% de células positivas, y luego FACS clasifica las células infectadas con EGFP positivo.
Después de la clasificación facs, deje que las células se recuperen en una incubadora de cultivo de tejidos durante al menos 24 a 48 horas, y luego prepare las células para análisis in vitro basados en células o injertos in vivo. Confirme la eliminación de Erbb4 realizando PCR utilizando ADN genómico aislado de una parte de las células EGFP positivas clasificadas. Realice los ensayos de proliferación durante los próximos siete días en células tumorales clasificadas chapadas en una placa de 96 pocillos utilizando un citómetro automatizado basado en imágenes.
Tiñe las células con ganchos y tintes de yoduro de propidio y capture las imágenes de las células utilizando un lector de placas automatizado para contar el número de células vivas y muertas en cada pozo. Aislar el ARN total de las células tumorales clasificadas utilizando el fenol ácido estándar y el método basado en cloroformo. Abra el software para realizar la alineación de la secuencia de ARN siguiendo los pasos específicos del programa utilizando la configuración predeterminada.
Seleccione el método de análisis, la búsqueda de ARN y, a continuación, seleccione el genoma de referencia del ratón. Cargue el archivo BED si el núcleo de secuenciación le proporciona uno. Cargue los archivos de secuenciación FASTQ y asigne nombres de réplica únicos a los archivos.
Agrupe los archivos FASTQ y designe los archivos en un conjunto de réplicas. Para el análisis estadístico y de normalización para identificar las señales diferenciales de expresión génica con potencia estadística robusta, abra el software de análisis y seleccione los archivos GFP FASTQ como el conjunto de datos de control. A continuación, seleccione DESeq2 como método estadístico y de normalización e inicie el ensamblaje y el análisis.
Utilice los conjuntos de datos de ontología génica integrados en las herramientas de análisis de enriquecimiento funcional de acceso abierto para realizar el análisis de enriquecimiento funcional en el DEG mediado por Erbb4 estadísticamente significativo identificado para determinar la importancia biológica y de la vía de la pérdida del gen Erbb4. Inyecte las células tumorales en el nervio ciático del ratón anestesiado para evaluar el potencial de crecimiento del aloinjerto in vivo en las células post-infectadas. Una vez que el tumor alcanza el tamaño requerido, diseccionar el tumor de un ratón sacrificado en dos o tres secciones, como se demostró anteriormente.
Fije una sección de tejido en 4% de paraformaldehído durante la noche y luego incruste la sección fija en la parafina. Después de hacer secciones de cinco micrómetros de grosor del tejido FFPE, monte la sección en los portaobjetos y confirme la presencia de células tumorales en el tejido injertado utilizando H & E e inmunotinción como se demostró anteriormente. Para confirmar las diferencias de expresión de Erbb4 in vivo entre las dos condiciones experimentales, tiñe el tejido fijado en formalina e incrustado en parafina con anticuerpos específicos de Erbb4.
Se analizó la transducción de las células tumorales malignas de la vaina del nervio periférico con adenovirus. Las células que expresan EGFP se detectaron mediante microscopía de fluorescencia, y el número total de células se determinó mediante microscopía de contraste de fase. Después de la ablación del gen mediado por Cre, dependiendo de la eficiencia de la transfección, el genotipado por PCR mostró un knockout genético completo y una población heterogénea de células inducidas y no inducidas en comparación con la transducción de control.
La histopatología característica encontrada en los aloinjertos ortotópicos de los tejidos tumorales malignos de la vaina del nervio periférico en comparación con los tumores derivados de los modelos animales originales genéticamente modificados demostró una diferencia en la morfología celular. La ablación de Erbb4 disminuyó la densidad celular y la proliferación celular en las células adeno5-CMV-Cre-ablated controlan las células transducidas adeno5-CMV-GFP. La expresión de Erbb4 en las células tumorales transducidas con adeno5-CMV-Cre, o virus EGFP, disminuyó en el resultado en los aloinjertos transducidos adeno5-CMV-Cre en comparación con los tumores de aloinjerto tratados con adeno5-CMV-EGFP de control.
La densidad vascular se evaluó mediante la detección de inmunorreactividad para CD31, y los resultados representativos mostraron una densidad vascular marcadamente reducida en los aloinjertos de células transducidas por adeno5-CMV-Cre en comparación con las células transducidas por adeno5-CMV-EGFP de control. Después de la ablación de genes, las células se pueden utilizar para muchos tipos diferentes de ensayos basados en células, como proliferación, migración, crecimiento 3D o alteraciones del microambiente, así como para inyecciones ortotópicas in vivo.
