Nuestro sistema permite a los investigadores evocar vibraciones no localizadas con propiedades bien controladas a desplazamiento no escalado y cuantificar la corriente de calcio durante las respuestas de los irritantes a las vibraciones. Como principal ventaja de esta técnica, podemos investigar de forma no invasiva los mecanismos neuronales, mecanismos subyacentes del comportamiento. Prepare un nuevo medio de crecimiento de nematodos o placa NGM en la que Escherichia coli OP50 esté rayada en un patrón cuadrado utilizando un esparcidor celular para que el gusano pase la mayor parte del tiempo en las bacterias durante las imágenes de calcio.
Cuatro días antes de un experimento de imágenes de calcio, transfiera dos gusanos ST12 adultos a la placa y coloque la placa en una incubadora de 20 grados Celsius durante cuatro días. Realice imágenes de calcio utilizando un microscopio equipado con un dispositivo de transductor acústico para la estimulación, una lente de objetivo 2x, una cámara CMOS de alta velocidad, óptica de división de imágenes. Encienda la computadora de precisión en el controlador de etapa motorizado X Y.
Luego encienda el amplificador y ajuste el ajustador de volumen a 10 en la base y los ajustadores de agudos a ocho. Para excitar GCaMP y etiquetar RFP, encienda las luces de 488 y 560 nanómetros de la fuente de luz LED. Ajuste los medidores de 470 y 550 nanómetros de la cápsula de control en la fuente de luz al 5% para que la intensidad de la luz LED sea adecuada para la obtención de imágenes.
Descargue e instale los siguientes paquetes de software y ventanas. Software de macros de ratón, software para control de vibraciones, software para seguimiento de ejecución y software para análisis de datos. Haga doble clic en el archivo de software de seguimiento, luego establezca el tiempo de exposición en 0.033 segundos y se vincule a dos por dos para garantizar una adquisición de imagen sin problemas.
Haga clic en el botón ejecutar y espere cinco minutos para estabilizar el software. Introduzca la información para la adquisición de imágenes. Por ejemplo, para grabar 500 imágenes sin un intervalo, escriba 500 en el cuadro total de imágenes, 500 en el cuadro de imágenes y cero en el cuadro intervalos.
Después de activar el botón de adquisición, divida la imagen de fluorescencia utilizando la óptica de división de imágenes, proyectando el canal GCaMP y etiquete el canal RFP en dos mitades de la cámara CMOS. Calibre las coordenadas del GCaMP y etiquete los canales RFP y guarde la configuración. A continuación, configure el directorio para generar el archivo de datos y desactive la adquisición.
Lea el ensayo. archivo de texto con el sistema de macros del ratón para que el cursor del ratón se controle en función de las coordenadas y la programación en ese archivo y haga doble clic en el archivo de software para el control de vibraciones. Establezca las coordenadas del cursor del mouse en tiempo de espera hasta la estimulación después de iniciar la grabación, luego configure la frecuencia y los valores de amplitud en el software para el control de vibraciones.
Transfiera un solo gusano que exprese tanto GCaMP como etiqueta RFP desde la placa incubada a una placa NGM fresca donde E coli OP50 ha sido rayada. Conecte la placa NGM al transductor acústico con cinta adhesiva transparente. Para obtener imágenes de calcio, active el botón de adquisición y busque el gusano con un aumento de 2.5x.
Establezca el campo de visión como 1,1 por 1,1 milímetros con una resolución de 2,6 micras por píxel. Apague la luz brillante y haga clic en el botón de búsqueda para rastrear el punto fluorescente de un gusano, que inicia el movimiento de la etapa X Y para mantener la región de máxima intensidad del gusano en el medio del campo de visión en la imagen RFP de la etiqueta. Asegúrese de que los valores de intensidad sean aproximadamente 1000.
De lo contrario, ajuste los medidores de 470 y 550 nanómetros de la cápsula de control en la fuente de luz. Presione el botón ejecutar en el sistema de macros del mouse para permitir el control del cursor del mouse y verifique que el archivo BMP de salida se haya creado correctamente. Para el análisis de datos, cree una carpeta en el escritorio y asígnele el nombre Calcium Imaging"luego cree una carpeta dentro de la carpeta Calcium Imaging y asígnele el nombre de resultado CI para los archivos de resultados de salida.
Haga doble clic en la imagen de vista dual. MB escrito en el software de análisis de datos e inserte las rutas de archivo a la carpeta de resultados de CI en la carpeta con el archivo BMP. Presione las teclas shift y return simultáneamente para iniciar un análisis automático, que utiliza el valor de una región de máxima intensidad en la imagen RFP de la etiqueta.
Finalmente, verifique si los archivos de salida se crean correctamente en la carpeta de resultados de CI. En el análisis representativo, se obtuvieron datos de canales GCaMP y TAG RFP como una serie de imágenes. También se cuantificó el desplazamiento de la placa de Petri inducido por un sistema de vibración no localizado.
El desplazamiento se puede controlar estableciendo el valor de amplitud en el software para el control de vibraciones, y el ajustador de volumen y el amplificador. Mientras que la frecuencia se puede regular estableciendo el valor de frecuencia en el software. Se observó una respuesta transitoria de calcio de las neuronas AVA tras la estimulación con vibraciones que tenían una frecuencia de 630 Hertz y un desplazamiento de aproximadamente 4,5 micrómetros por segundo, lo que indica que la neurona Ava se activó durante la respuesta hacia atrás de un gusano a la estimulación no localizada.
En nuestro procedimiento, podemos cuantificar una sola neurona. Sin embargo, este sistema también se puede combinar con un método de imágenes biométricas para cuantificar de forma no invasiva múltiples neuronas o incluso todo el cerebro.
