El pez cebra ofrece un valioso modelo de regeneración neuronal debido a su capacidad para recuperarse de una lesión de la médula espinal. Este método describe la resistencia a la natación y el comportamiento de natación como lecturas de la reparación funcional de la médula espinal. Esta técnica proporciona una evaluación confiable y cuantificable de la resistencia a la natación y el comportamiento de natación en peces cebra adultos.
Estos métodos son igualmente aplicables a los estudios del desarrollo neuromuscular y musculoesquelético, la enfermedad y la regeneración. Para evaluar la resistencia a la natación, abra el software de control de velocidad de flujo. Haga clic en la casilla etiquetada Experimento y desmarque Uswim y Uwater.
Luego cambie la velocidad del flujo en la caja Uwater en la parte inferior izquierda para ajustar las velocidades de la corriente de agua. Para comenzar un protocolo automatizado, haga clic en el cuadro Iniciar registro. En la ventana de diálogo que se abre, elija Automatizado en la lista desplegable.
Para abrir un archivo de protocolo guardado anteriormente, haga clic en el icono de archivo junto al archivo de protocolo. A continuación, configure el archivo de salida haciendo clic en el icono de archivo junto al archivo de registro. En la ventana del explorador de archivos que se abre, asigne un nombre al archivo de salida y guárdelo en la ubicación deseada.
Luego, configure una ventana de temporizador de vuelta dividida para garantizar el acceso simultáneo al software de control de velocidad de flujo y las ventanas del temporizador en la pantalla de la computadora. A continuación, configure un tanque de recolección de peces para albergar a los peces agotados después de su eliminación del túnel de natación. Llene el tanque de recolección y un tubo largo de cloruro de polivinilo con agua del sistema de pez cebra.
Coloque un extremo del tubo precargado en el tanque de recolección y otro en el tanque de amortiguación, asegurando que el agua pueda fluir libremente desde el tanque de amortiguación hacia el tanque de recolección. Sujete el extremo superior del tubo con un clip aglutinante para evitar el flujo de agua y use el clip aglutinante para controlar la salida de agua según sea necesario. Cierre el túnel de natación con la tapa de resistencia a la natación antes de colocar un grupo de peces dentro del túnel de natación.
Para aclimatar a los peces al túnel de natación y la dirección del flujo, inicie el temporizador de vuelta dividida y ajuste la velocidad actual a cero centímetros por segundo durante los primeros cinco minutos, nueve centímetros por segundo durante los próximos cinco minutos y 10 centímetros por segundo durante los siguientes cinco minutos. Después de la aclimatación, abra el protocolo e inicie el programa automatizado de control de velocidad de flujo, que aumentará la velocidad de la corriente de agua en dos centímetros por segundo cada minuto. Controle el agotamiento de los peces.
Los peces agotados serán empujados hacia el extremo posterior del túnel de natación. Para asegurarse de que un pez esté agotado, toque suavemente el extremo posterior del túnel o cree una sombra sobre esa área para estimular a los peces a nadar. Los peces exhaustos no respondieron al estímulo de sobresalto y se acostaron en la parte posterior del túnel.
Cuando un pez se agote, desenganche el tubo de recolección de pescado. Abra la ventana del túnel de natación y recoja los peces en el tanque de recolección. Registre el tiempo de agotamiento utilizando el temporizador de vuelta dividida.
Después de que todos los peces se agoten y se recojan en el tanque de recolección, haga clic en el botón Parada de emergencia en el software de control de velocidad de flujo y detenga el temporizador. Para capturar películas para el ensayo de comportamiento de natación, coloque un grupo de peces en el túnel de natación y cierre el túnel con una tapa estándar completamente cerrada. Luego, abra una nueva ventana de grabación y asigne un nombre al archivo.
No haga clic en Grabar todavía. Antes de comenzar un nuevo experimento, coloque una toalla de papel o un trozo de tela en el costado del túnel de natación para asegurarse de que todos los comportamientos se deban a la natación de los peces, y no a una respuesta de sobresalto causada por el movimiento en el medio ambiente. Después de asegurarse de que el agua esté en calma y que no se muevan ondulaciones a través del marco, haga clic en Grabar en la ventana del software de la cámara para comenzar a grabar el archivo de película.
Luego haga clic en Inicio en el software de control de velocidad de flujo para comenzar el protocolo, que continuará sin interrupciones. Mire la película para asegurarse de que no se caigan fotogramas, no haya burbujas en el campo de visión y se registren todos los peces. Una vez completada la grabación de la película, haga clic en Parada de emergencia para finalizar el protocolo de control de velocidad de flujo y verifique que el archivo de salida de datos se guarde automáticamente.
Luego, cierre la ventana de grabación para guardar el archivo de película. Después de la grabación, retire la tapa. Recupere cuidadosamente los peces y devuélvalos a su tanque.
Para analizar las películas capturadas, abra el tracking_v2. ijm script en Fiji y haga clic en Ejecutar para comenzar el programa. En la ventana emergente, elija la carpeta que contiene las películas de comportamiento de natación para rastrear y haga clic en Abrir.
Busque el fotograma de una de las primeras películas, un cuadro de diálogo y la región de interés, o administrador de ROI, que aparecerá. Siga las instrucciones dadas en el cuadro de diálogo y cree un ROI en la parte inferior de la cámara del túnel de natación. Luego haga clic en Aceptar y asegúrese de que no se vean esquinas negras.
La ventana de umbral se abrirá junto con un marco de umbral editado. Cambie el esquema de color de blanco y negro a rojo y ajuste el valor máximo hasta que el fotograma uno solo muestre el pez en rojo y nada más. Registre el umbral y haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo.
Para alinear, ensamblar y adquirir estadísticas descriptivas, abra el SwimBehavior_v7-3. R script en RStudio y haga clic en Fuente en la esquina superior derecha de la sección de script. En una nueva ventana que se abre, elija la carpeta que contiene el _raw.
csv generados por Fiji y haga clic en Abrir. El programa se ejecutará automáticamente. En el cuadro de diálogo emergente, confirme el número de peces en cada película.
Haga clic en Sí si los números dados son correctos o no si los números son incorrectos. Una vez que los archivos estén alineados, compruebe si hay un _aligned recién generado. archivo csv.
Después de asegurarse de que el programa combina los datos, ejecuta estadísticas y traza gráficos de salida, compruebe si hay archivos de análisis generados en una nueva carpeta con la etiqueta Resultados dentro de la carpeta principal que contiene el _raw. csv y _aligned. archivos csv.
La resistencia a la natación evaluada a las dos, cuatro y seis semanas después de la lesión mostró una pérdida del 60% de la capacidad de resistencia a la natación a las dos semanas. Los peces regeneradores recuperaron gradualmente la resistencia a la natación a las cuatro y seis semanas después de la lesión. En el ensayo de comportamiento de natación, los controles nadaron constantemente en la parte delantera de la cámara del túnel de natación correspondiente a una posición Y elevada.
En contraste, a las dos semanas después de la lesión, los peces lesionados no pudieron mantener una capacidad de natación constante contra la corriente. En consecuencia, sus pistas de natación son más irregulares, con una disminución general en la posición Y. La posición Y aumentó a las cuatro y seis semanas después de la lesión, lo que indica que los animales regeneradores recuperaron gradualmente su capacidad de nadar.
Además, en relación con los controles no lesionados, los animales lesionados a las dos semanas posteriores a la lesión fueron marcadamente menos activos, se estancaron en el cuadrante posterior del túnel de natación y perdieron su capacidad de nadar contra velocidades de baja corriente. De acuerdo con su capacidad innata para lograr la recuperación funcional, los animales lesionados normalizaron gradualmente los parámetros de comportamiento de natación a las cuatro y seis semanas posteriores a la lesión. El uso del software de control de velocidad de flujo en este protocolo es opcional.
La alternativa es controlar manualmente el motor de corriente de agua. Los ensayos descritos en este estudio se pueden utilizar para detectar fenotipos neurales, musculares o esqueléticos. El tejido de interés puede ser cosechado para un examen histológico o molecular.
Nuestro laboratorio y otros han utilizado este protocolo para identificar genes que son necesarios para la reparación neuronal innata y factores que son suficientes para mejorar la regeneración neuronal.
