This work was supported by a Howard Hughes Medical Institute Education Grant and an internal grant from the Saint Joseph's University chapter of Sigma Xi. We would also like to thank the three anonymous reviewers who helped strengthen the protocol and interpretations.

Las siguientes metodologías para la vivienda, la atención, y el estudio de pez cebra han sido aprobados por la Universidad CICUAL de San José. 1. El pez cebra vivienda, la asistencia <ol><li> Obtener el pez cebra objeto de un proveedor local, o de poblaciones silvestres capturados. Tenga en cuenta que el pez cebra vivienda está sujeta a las directrices del IACUC y permisos adicionales son necesarios para las poblaciones silvestres capturados vivienda. </li><li> Identificar y pez cebra por separado en función del sexo. Alternativamente, omita este paso o reemplazar con un método diferente de la separación basada en la hipótesis de estudio. NOTA: Las características sexuales son difíciles de determinar en el pez cebra, sobre todo en las mujeres. Consulte estas directrices 10 o manuales en línea útiles para distinguir el sexo. </li><li> Aleatoriamente separar las poblaciones más lejos en la proporción adecuada de peces focal a los estímulos de pescado. Nota: los peces focal son los sujetos de prueba siguieron a través de la serie de behavioLos ensayos ral, y peces de estímulo son las personas que van a ocupar las cámaras de estímulo en los ensayos de la agresión y los cardúmenes. NOTA: Tradicionalmente, entre el 1 y el 5 de estímulo peces por peces focal en ensayos shoaling y una mezcla 1: 1 de estímulo: se usa una relación focal de pescado en los ensayos de agresión 14,17. Sin embargo, el investigador necesita diseñar específicamente el estudio con la hipótesis en mente (es decir, debe estímulo pescado se mantiene constante para mantener la consistencia en el comportamiento de los peces focal, o debería estímulo puede girar peces entre cada ensayo para asegurar la aleatorización adecuada). </li><li> Almacenar todos los peces en bastidores de vivienda de pez cebra (27,5-28,5 ° C) bajo una estricta 12:12 ciclo luz / oscuridad. Alimentar a todos los alimentos focal y estímulo peces de escamas diario y semanal artemia, en días no investigación. </li><li> Asegúrese de que todas las pruebas se realiza entre ZT1 y ZT5 (tiempo zeitgeber) para evitar los efectos del ritmo circadiano 26. </li></ol> 2. La asignación al azar y del tanque de instalación <ol><li> Real academia de bellas artesndomize todas las personas a priori a una secuencia específica de ensayos de comportamiento. Establecer un sistema de aleatorización coherente utilizando un generador de secuencia aleatoria línea 27 o un generador de secuencias al azar de un paquete de software estadístico (R). <ol><li> Etiqueta de cada ensayo de 1 a 3 y mantener esta asignación consistente. Asignar una secuencia aleatoria de cada individuo y un mapa de la secuencia de acuerdo con la etiqueta de ensayo de conducta. Por ejemplo, para los tres ensayos totales (1 asignadas a Shoaling, 2 asignada a la audacia, y 3) asignados a la agresión, un individuo dado puede tener una secuencia aleatoria de &#39;2,3,1&#39;, lo que les obligará a realizar la específica ensayos de comportamiento en la secuencia especificada. </li></ol></li><li> Configurar los tanques de ensayo (audacia, la agresión y shoaling) en el laboratorio en lugares que reduzcan al mínimo la posibilidad de que los estímulos externos adversos y asegúrese de tener suficiente espacio para una cámara de vídeo para capturar todo el tanque. Asegúrese de que la videocámara ha enough claridad para ver etiquetas en los tanques, así como ser capaz de distinguir los comportamientos sutiles de los peces focal y la configuración de la videocámara en esta posición. </li><li> Registrar todos los ensayos de comportamiento con la cámara se mantiene en la misma posición con una vista completa del depósito especificada para minimizar las diferencias no intencionadas en la puntuación de comportamiento como resultado de las grabaciones diferenciales. NOTA: Evite colocar los tanques en zonas de tráfico pesado y por puertas como el movimiento y el sonido afectará el comportamiento del pez cebra. </li><li> Establecer protocolos únicos JWatcher 24 al eliminar cada ensayo conductual. Consulte el manual de JWatcher para aprender cómo crear archivos maestros focales para asignar comportamientos a las pulsaciones del teclado y los ficheros de análisis focales para resumir los datos recogidos. NOTA: JWatcher es un software que permite scoring de comportamiento para la puntuación del comportamiento fiable y repetible personalizado 24. </li><li> Definir un sistema de etiquetado para realizar un seguimiento de la fecha, el número de peces, y el número de ensayo para todos los ensayos de comportamiento (por ejemplo,Fish 5, ensayo Audacia, &#39;F5-B-123115 &quot;, sugiriendo que en el 31 de Diciembre de 2015) y la etiqueta de la parte exterior del tanque con cinta adhesiva a la vista y en el enfoque de la cámara. Mantener y registrar esta información en un cuaderno de laboratorio para una referencia rápida y el control de calidad futura. </li><li> Establecer un tanque de aclimatación que se utilizará entre todos los ensayos, así como directamente después de que los individuos se quitan del bastidor de la vivienda. NOTA: Los tanques de aclimatación y tanques terminales son pequeños acuarios (40 cm x 20 cm x 25 cm) con grava y un filtro que se parecen mucho a la rejilla de la vivienda. </li><li> Después de los ensayos se encuentren todos completos, transferir al individuo en un tanque de terminal separada, que servirá como el tanque de destino final para todos los individuos focales utilizados. Utilice un tanque que es lo suficientemente grande para alojar un grupo de individuos para el resto de su vida (por ejemplo, 25 galones). NOTA: Es muy importante para mantener la temperatura y las condiciones del agua consistentes y similares Across todos los tanques. Esto incluye la vivienda, la aclimatación, y todos los tanques de prueba. </li></ol> 3. Llevar a cabo el ensayo de Agresión <ol><li> Llevar a cabo el ensayo de la agresión en un tanque rectangular 19 L medir 30 cm x 15 cm x 10 cm. Equipar el tanque en particiones opacas externo que rodea tres lados del tanque agresión, dejando la parte delantera expuesta para la visión, para reducir los estímulos externos indeseables. Se divide el tanque con marcas externas en cuatro cuadrantes rectangulares iguales y fijar un espejo de forma permanente (con masilla de silicona) en el cuadrante inferior izquierdo, inclinada a 22,5 ° formando un triángulo rectángulo contra el extremo izquierdo de la cisterna. </li><li> Asegúrese de que la temperatura del agua en el tanque de depósito de aclimatación y la agresión está dentro de 2 ° C de la cremallera de la vivienda. Para ello, se han pre-calentado, agua fresca edad de 27,5 a 28,5 ° C listo para añadir al tanque de agresión. Tenga en cuenta que es importante cambiar el agua entre cada ensayo para eliminar injustificadaseñales olfativas. </li><li> Transferencia, ahuecando, un pez focal del bastidor vivienda a un tanque de aclimatación separada donde se aclimaten durante 10 min. NOTA: Es importante reducir el estímulo introducidas a los peces a través de una manipulación incorrecta. Individuos transferencia descritos anteriormente 27. <ol><li> En concreto, manualmente y con cuidado coloque un vaso de plástico pequeña y transparente en el tanque de interés. Sin interrumpir el pescado tanto como la transferencia mediante el uso de una red, cucharada lentamente por el pescado en la taza. </li></ol></li><li> Asegúrese de que la cámara de vídeo está listo para grabar al confirmar que el depósito de ensayo de la agresión (véase el paso 3.1) está en el foco e inmediatamente antes de la transferencia de la persona en el tanque de la agresión, registro de prensa en el dispositivo. Transferir peces focal a través de ventosas del tanque de depósito de aclimatación a la agresión. NOTA: Es importante registrar antes de que el pescado que entra en el tanque de la agresión para controlar el tiempo exacto de la entrada. </li><li> Registre el aggrtanque ESIÓN de 10 min y 30 seg y luego taza el pescado focal desde el tanque de la agresión de nuevo en el tanque de aclimatación. </li><li> Cuando se ve la grabación, espere 30 segundos después de que el pescado ha sido introducido en el tanque como un período de aclimatación adicional antes de comportamientos de puntuación. </li><li> Usando el sistema de puntuación JWatcher definido para los comportamientos agresivos, cuantificar los siguientes comportamientos durante 10 minutos: El tiempo pasado cerca de espejo, serie de enfoques espejo, número de dardos, número de intentos de picaduras (boca de apertura en la dirección del espejo), y el número de pantallas laterales (dorsal, pectoral, anal, y la erección de la aleta caudal) 9. </li><li> Anotar un solo ensayo de la agresión al menos dos veces, hasta que el ensayo se anotó con un alto acuerdo entre iteraciones. </li></ol> 4. Llevar a cabo el ensayo de Audacia <ol><li> Llevar a cabo el ensayo de confianza en un pequeño tanque trapezoidal de 1,5 l, que mide 15 cm de alto x 26.5 cm x 22.5 cm de la parte superior de ancho de fondo x 6 cm. Envuelve el papel opaco alrededor de todos los lados of del tanque, pero dejan la parte delantera expuesta para su visualización. Colocar una sola pieza, delgada de cinta externa al tanque para demarcar la parte superior de la parte inferior del tanque. </li><li> Asegúrese de que la temperatura del agua en el tanque de la audacia es de 2 ° C de la cremallera de vivienda (véase el paso 3.2) </li><li> Transferir el pescado focal del bastidor vivienda al tanque de aclimatación (véase el paso 3.3) y dejar que se aclimaten durante 10 min. </li><li> Asegúrese de que la videocámara está lista para grabar el ensayo audacia y, una vez listo para transferir los peces focal, registro de prensa en el dispositivo. Transferir el pescado focal desde el tanque de aclimatación al tanque de audacia y grabar durante 8 min y 30 seg. </li><li> Cuando se ve la grabación, permitirá por un período adicional de aclimatación de 30 segundos después de que el pescado se introduce en el tanque antes de anotar. </li><li> El uso de software JWatcher, cuantificar los comportamientos audacia durante 8 minutos. En concreto, cuantificar los siguientes comportamientos: Tiempo cerca de la superficie, la latencia para entrar en la parte superior, el número de transitions en la parte superior, y el número de movimientos erráticos (dardos) 29. </li><li> Anotar un solo ensayo osadía al menos dos veces, hasta que el ensayo se anotó con un alto acuerdo entre iteraciones. </li></ol> 5. Llevar a cabo el ensayo Shoaling <ol><li> Llevar a cabo el ensayo de los bancos de arena en un tanque de 76 L que tiene tres compartimientos divididos por dos divisores de vidrio sellado con masilla de silicona (los tres compartimentos resultantes consisten en dos zonas de estímulo y un compartimiento central). Externamente, marcar dos zonas designadas de preferencia de 6,35 cm de cada una de divisor de vidrio de las zonas de estímulo &#39;, indicativo de dos largos de cuerpo 30. Aplicar tabiques opacos externamente en torno a tres lados del tanque de los bancos de arena, pero dejando la parte delantera expuesta para su visualización. NOTA: Esta zona de preferencia se puede personalizar para probar la hipótesis específicas para las diferentes especies de tamaño. </li><li> Dependiendo de la naturaleza del estudio, seleccione Shoals de estímulo que se aclimaten durante al menos 12 horas se acabene probar y permanecer en el tanque de shoaling durante todo el curso del experimento. NOTA: bancos de arena de estímulo son colecciones de peces individuales que se utilizan para evaluar cómo los peces focal se comporta de la presencia o ausencia de estos bancos de arena. Las diferentes combinaciones de estímulo bajío se pueden seleccionar para probar un número de diversas hipótesis shoaling. Asegúrese de que los bancos de arena de estímulo se rotan entre cada zona de estímulo para evitar el sesgo lateral y también se dejan aclimatar durante al menos 12 horas antes de la prueba. </li><li> Transferir el pescado focal en el tanque de aclimatación como se describe anteriormente (véase el paso 3.3) </li><li> Transferir, ahuecando, el pescado focal desde el tanque intermedio para la aclimatación del compartimiento central en el depósito de los bancos de arena. </li><li> Permitir un periodo de aclimatación de 10 minutos antes de un periodo de observación en vivo de puntuación 10 min. Como alternativa, registrar los ensayos shoaling y la puntuación más tarde usando JWatcher. Los peces se determinó que los bancos de arena cuando están dentro de la zona de preferencia en la cámaraque alberga el bajo fondo blanco. </li><li> Cuantificar el tiempo empleado en cada zona de preferencia y el tiempo invertido en el volumen central. </li><li> Como una medida descriptiva adicional, calcular &#39;fuerza de los bancos de arena&#39; (SOS). Asignar un valor entre -1 y +1, donde la magnitud describe cómo a menudo una bancos de peces individuales. </li><li> Calcular la relación entre los bancos de arena tiempo empleado dividido por el área de las zonas shoaling y restar la proporción de tiempo dedicado no shoaling y el área de las zonas no shoaling. Coloque esta cantidad sobre la suma del tiempo transcurrido en cada zona dividida por el volumen de cada zona individualmente. Más información acerca de este cálculo se puede encontrar en un estudio previo 14. </li></ol> 6. Control de Calidad de los Datos <ol><li> Analizar los datos utilizando los datos tradicionales herramientas de análisis de 31-32. </li><li> Prueba de homogeneidad de varianza utilizando la prueba no paramétrica de Levene para todos los comportamientos. Si un comportamiento es no homogénea realizar una transformación logarítmica33. </li><li> Confirman que no hay efectos de secuencia (es decir, que la orden de asignación al azar no afectó el comportamiento de los individuos) utilizando un ANOVA de Kruskal-Wallis en los datos homogéneos 34. </li><li> Confirman que no hay sesgos laterales para el ensayo de los bancos de arena mediante la creación de modelos lineales generales en los índices univariados SoS con la cara como un factor fijo 35. NOTA: Si hay poco que no hay problemas con los datos, los análisis posteriores se pueden realizar. Si hay problemas, reconciliarse con transformaciones y racionalizar con explicaciones plausibles biológicamente, y / o aumentar el tamaño de las muestras. </li></ol> 7. Análisis de datos <ol><li> Rangos de Spearman calcular las correlaciones de dos colas 36 para todos los comportamientos por separado dentro de los ensayos de audacia y agresividad. </li><li> Calcular los coeficientes de correlación intraclase (CCI) como un modelo mixto de dos vías con coherencia para los ensayos de comportamiento que se llevaron a cabo más de un time para un determinado individuo 36. En esta configuración, la CPI es una medida de qué tan consistentemente un pez comportado de un mismo ensayo mide más de una vez. </li><li> Preprocess audacia y agresividad comportamientos de centrado y normalizar todos los comportamientos que se preparan para la entrada a un análisis de componentes principales (ACP) 25. NOTA: Preprocesamiento de las mediciones realizadas por el centrado y normalizar es un paso vital. Sin este paso de preprocesamiento de los comportamientos que se producen con más frecuencia y más variable influirá en exceso las interpretaciones de los componentes extraídos. El proceso de centrado y normalizar eliminará este sesgo. </li><li> Realizar un PCA con una matriz de correlación para determinar si la audacia y la agresión están unidos entre sí como un síndrome conductual. Interpretar cargas de comportamiento de cada componente significativo en&gt; 0,6. Ver Budaev 2010 24 para una guía completa para informar PCA para los estudios de comportamiento. Un gráfico de sedimentación será informativo en el que eigenvectors deben mantenerse para la interpretación. </li><li> El uso de software estadístico, como SPSS o R 31,32, extraer las puntuaciones para cada componente para cada individuo. Las puntuaciones representan la cantidad de comportamiento del individuo dado puede ser explicada por el componente particular. </li><li> Calcular correlaciones de rangos de Spearman entre las puntuaciones de regresión de los factores y la fortaleza de los bancos de arena 36. NOTA: Un síndrome conductual se considera presente si la audacia y la agresión comportamientos se cargan en el mismo componente o, si algún componente con cargas significativas interpretables se correlaciona con la fuerza de los bancos de arena. Además, tenga en cuenta que la fuerza de los bancos de arena no está incluido en el PCA para dar mejores interpretaciones de las cuantificaciones de comportamiento más complejos (audacia y la agresión). El PCA ortogonalmente colapsar audacia y agresividad características en vectores propios para maximizar la cantidad de variación explicada y es muy adecuado para estas mediciones complejas. Interpretaciónla resultante vectores propios y la regresión de nuestra fuerza de las mediciones de agrupamiento que en cada uno de ellos da una interpretación mucho más intuitiva de cómo cada uno de los comportamientos complejos (audacia y agresión) se refieren a una medida shoaling binaria más bien definido (es decir, los peces se shoaling o no shoaling). </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EthoVision:+a+versatile+video+tracking+system+for+automation+of+behavioral+experiments.">EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments.</a> Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).</li><li>Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personality+traits+and+dispersal+tendency+in+the+invasive+mosquitofish+(Gambusia+affinis).">Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis).</a> Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).</li><li>Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explaining+leptokurtic+movement+distributions:+intrapopulation+variation+in+boldness+and+exploration.">Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration.</a> Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).</li><li>Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+syndromes+differ+predictably+between+12+populations+of+three-spined+stickleback.">Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback.</a> J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).</li></ol>

The authors (GW and SPM) have no competing financial interests or conflicts of interest.

El protocolo determinará si existen asociaciones consistentes en la audacia, la agresión y los comportamientos de agrupamiento que en el pez cebra. Si hay asociaciones consistentes en una población dada entre cualquiera de estos comportamientos, a continuación, un síndrome de comportamiento está presente. Mediante el estudio de síndrome de comportamiento natural de una población, los investigadores pueden tener una comprensión más completa de su dinámica de comportamiento, estructura de la población, y, posi...

Hay un creciente cuerpo de literatura que investiga las asociaciones entre los comportamientos distintos dentro de cada animal a partir de una población determinada. Estas asociaciones se denominan síndromes de comportamiento, y las mediciones suelen incluir la audacia, la agresión, la conducta exploratoria, y la sociabilidad 1-5. síndromes conductuales son valiosos por razones tanto directos como indirectos. Directamente, el conocimiento de los síndromes del comportamiento pueden dar una visión más completa de la teoría de la evolución, estructura de la población, y la dinámica de la población 3. Indirectamente, el conocimiento en relación con las asociaciones de comportamiento puede informar a los campos que cuantifican el comportamiento tales como la farmacología 6, 7 toxicología, genética del comportamiento 8,9, 10 y endocrinología. Debido a estos beneficios directos e indirectos, un mayor conocimiento de los síndromes de comportamiento es especialmente valiosa en organismos modelo de uso común como el pez cebra. Los estudios que utilizan el pez cebra se encuentran ina variedad de disciplinas, incluyendo el análisis de los síndromes conductuales 11-13. Para avanzar en el conocimiento en la investigación síndrome conductual, y debido a otras disciplinas también utilizan mediciones de comportamiento para las pruebas de hipótesis, se requieren descripciones sucintas fiables y de comportamiento para los análisis y las interpretaciones válidas y protocolos normalizados que facilitará las comparaciones entre los estudios dentro de las especies. El protocolo fue desarrollado para medir un síndrome conductual audacia-agresión-bancos de arena en una población de pez cebra criados en el laboratorio 14. Sin embargo, la base del protocolo (seguimiento de peces individuales, asegurando la asignación al azar adecuada y análisis apropiados) puede ser modificado fácilmente para una variedad de medidas alternativas de comportamiento. Además, los ensayos de la audacia, la agresión, o de agrupamiento que se pueden ejecutar de forma individual para la verificación de hipótesis distintas. Por lo tanto, si bien es nuestro objetivo para describir cómo llevar a cabo un estudio síndrome conductual y el protocolo para el éxito de l individuoLa medición del comportamiento evel, cada faceta de este procedimiento puede estar solo. La literatura sobre los síndromes conductuales abarca varios grupos taxonómicos, de artrópodos para los seres humanos y 4, con el fin de medir un síndrome de comportamiento, por lo menos dos contextos de comportamiento deben ser cuantificados. Desafortunadamente, a menudo hay poca consistencia en los ensayos que se utilizan para cuantificar la medición del comportamiento a través de los ejes de comportamiento. Por ejemplo, en los peces, teniendo libertad se puede medir utilizando ensayos de laberinto en T, ensayos de campo abierto, o la introducción de una novela o estímulo exterior 15. Los estudios de agresión en el pescado podrían implicar interacciones diádicas, ensayos de estímulo de vídeo, o ensayos de modelo de arcilla 12,16,17. Del mismo modo, el análisis de comportamiento shoaling, que implica típicamente la medición de preferencia shoalmate, se puede realizar en diferentes tipos de tanques, con diferentes métodos para determinar el tiempo de asociación 21-23. En este protocolo un subconjunto específico de la overase presenta ll repertorio ensayo conductual. En concreto, este protocolo presenta una metodología para realizar un seguimiento de los individuos a través de la audacia, la agresión, y los ensayos de agrupamiento que de una manera que facilita las comparaciones dentro de los individuos para determinar si las comparaciones son coherentes en todos los individuos dentro de una población. Hemos llevado a cabo este protocolo con el pez cebra y cíclidos convictos (Amatitlania nigrofasciata) en estudios previos 14,18, y funcionará con cualquier pez de agua dulce de tamaño similar. ensayos de Intrepidez se llevan a cabo en un tanque trapezoidal 1,5 L que tiene una línea horizontal delimitar las zonas de igual tamaño en las partes superior e inferior del tanque. comportamientos cuantificados incluyen el número de transiciones por los peces del ensayo entre la parte superior e inferior del tanque, el tiempo de cada porción, el número de dardos, y la latencia para entrar en la parte superior. El ensayo se lleva a cabo la agresión en un tanque rectangular 19L que incluyeun espejo de 3 pulgadas x 5 pulgadas inclinada en unos 22 ° situados en la esquina inferior izquierda del depósito 19. Cuantificados comportamientos incluyen la cantidad total de tiempo dedicado por los peces objetivo interactuar con el espejo 20, junto con los indicadores específicos agresivos - número de picaduras, pantallas laterales, dardos entre los peces del ensayo y su reflejo. Para estos indicadores específicos, las picaduras se definen como estocadas rápidas hacia el espejo con la boca abierta, pantallas laterales se definen como el aleteo de las aletas laterales, pectorales, dorsal y anal en la dirección del espejo, y dardos son los movimientos erráticos que son no se dirige hacia el espejo. Por último, el ensayo shoaling cuantifica el comportamiento de un pez de ensayo en cámara central de un tanque de tri-cámaras. Las cámaras laterales del tanque son o vacío, o contienen una &quot;diana de bajo fondo&quot; de los peces, y el tiempo de los peces del ensayo pasa cerca de cada cámara lateral se mide 21-23. Una puntuación compuesta única, conocida como StrenGTH de Shoaling (SOS), se calcula para cada pez de ensayo individual, específica a los estímulos, y se puede utilizar en los análisis de aguas abajo 14. Todos los comportamientos son calificadas por un solo espectador, o múltiples espectadores utilizando el software de cuantificación del comportamiento libre conocido como JWatcher 24. Prueba de la presencia de un síndrome conductual es ante todo un esfuerzo estadístico, y es aconsejable seguir las pautas que se presenta por Budeav 2010 25. En concreto, se recomienda realizar un análisis de componentes principales (PCA) en los datos centrados y normados en la que el insumos son los vectores de los comportamientos de un individuo en ensayos con las mediciones de comportamiento múltiples (es decir, la audacia y la agresión). La PCA, se realiza en una matriz de correlación, reduce la dimensionalidad de las mediciones de comportamiento, y por lo tanto extrae el conocimiento más importante que explica la mayoría de la variación. Los componentes extraídos a continuación, pueden ser interpretados based en altas cargas de factor para el comportamiento individual de las puntuaciones de interés y de regresión se puede extraer para cada individuo sobre la base de los componentes explicativas. Estas puntuaciones de regresión pueden ser comparados con la medición de SOS y otras diversas mediciones no conductuales tales como el tamaño del pez o el sexo. Este flujo de trabajo se ha aplicado en un estudio de los síndromes de comportamiento del pez cebra en el que se descubrió un síndrome específico de comportamiento sexual que existe entre la audacia y bancos de arena 14. En esta situación, más audaz machos de pez cebra son más propensos a asociarse con una especie más grande, más agresivos (D. albolineatus), pero esta asociación se pierde en las mujeres. Este flujo de trabajo también se llevó a cabo en un estudio de convicto familiares menores de cíclidos (Amatitlania nigrofasciata) 18 en la que no fue descubierto un síndrome conductual, lo que podría indicar la plasticidad de comportamiento de la especie. Por lo tanto, el siguiente protocolo se presenta won un objetivo de delinear la naturaleza de tres ensayos específicos (audacia, la agresión y shoaling) en el marco del estudio de un síndrome de comportamiento a nivel individual.

<table><tbody><tr><td>Zebrafish Rack System</td><td>Aquaneering Inc</td><td>Cat. # ZS550</td><td></td></tr><tr><td>Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g</td><td>Pet Valu</td><td>Cat. # 31700</td><td></td></tr><tr><td>Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 L Trapezoidal Tank</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>Cat. # itsts-a</td><td></td></tr><tr><td>19 L rectangular tank</td><td>That Fish Place</td><td>211932</td><td></td></tr><tr><td>76 L rectangular tank</td><td>That Fish Place</td><td>212180</td><td></td></tr><tr><td>Hitachi KP-D20A CCD Camera</td><td>Prescott&#039;s, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3&quot; x 3&quot;</td><td>Michaels</td><td>Cat. # 10334162</td><td></td></tr><tr><td>Jwatcher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS Statistics Base</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

boldness, aggression, and shoaling assays for zebrafish behavioral syndromes

Existe un síndrome de comportamiento cuando los comportamientos específicos interactúan en diferentes contextos. El pez cebra han sido sujetos de prueba en estudios recientes y es importante para estandarizar los protocolos para asegurar análisis e interpretaciones adecuadas. En nuestros estudios anteriores, hemos medido la audacia mediante el control de una serie de comportamientos (tiempo cerca de la superficie, la latencia en las transiciones, el número de transiciones y dardos) en un tanque trapezoidal de 1,5 l. Del mismo modo, se cuantificó la agresión por las picaduras de observación, pantallas laterales, dardos, y el tiempo cerca de un espejo inclinado en un tanque de 19 l rectangular. Al dividir un tanque de 76 L en tres partes, que también examinó las preferencias shoaling. El ensayo de los bancos de arena es un ensayo altamente personalizable y se puede adaptar para las hipótesis específicas. Sin embargo, los protocolos para este ensayo también debe ser estandarizada, pero lo bastante flexible para la personalización. En estudios previos, cámaras extremas eran o vacío, contenían 5 ó 10 peces cebra, o 5 Danios perla (D. albolineatus). En el folLowing manuscrito, se presenta un protocolo detallado y datos representativos que acompañan a las aplicaciones exitosas del protocolo, lo que permitirá la replicación de experimentos síndrome conductual.

Dependiendo de la naturaleza del estudio, y el protocolo específico empleado, varios resultados diferentes son posibles en un experimento de síndromes del comportamiento. Las siguientes tablas y figuras, donde se indica, son una adaptación de nuestro estudio anterior publicado en la revista Behavioural Processes 14 y 17 de la revista de pez cebra. Cuando la propuesta (como se describió anteriormente) se lleva a cabo en su totalidad, dos conjuntos de resultados, ...

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Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

Audacia, la agresión y ensayos para formar bancos de pez cebra de comportamiento Síndromes

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

boldness-aggression-shoaling-assays-for-zebrafish-behavioral

Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K vistas.  Saint Joseph’s University. This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

Video: Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un ensayo de conducta para medir la capacidad de respuesta de pez cebra a cambios en la intensidad de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Investigación

Biología

Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of stress-related diseases and psychiatric disorders, yet further studies into the genetic and neuronal regulation of stress are still required to develop better therapeutics. The zebrafish provides a powerful genetic model to investigate the neural underpinnings of stress, as there exists a large collection of mutant and transgenic lines. Moreover, pharmacology can easily be applied to zebrafish, as most drugs can be added directly to water. We describe here the use of the 'novel tank test' as a method to study innate stress responses in zebrafish, and demonstrate how potential anxiolytic drugs can be validated using the assay. The method can easily be coupled with zebrafish lines harboring genetic mutations, or those in which transgenic approaches for manipulating precise neural circuits are used. The assay can also be used in other fish models. Together, the described protocol should facilitate the adoption of this simple assay to other laboratories.

This manuscript describes a simple method to measure stress behaviorally in adult zebrafish. The approach takes advantage of the innate tendency that zebrafish prefer the bottom half of a tank when in a stressful state. We also describe methods for coupling the assay with pharmacology.

Enfoques conductuales para estudiar el estrés innato en el pez cebra

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

Comportamiento

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizados análisis de comportamiento de alto rendimiento en larvas de pez cebra

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Neurociencias

The Three-Chamber Choice Behavioral Task using Zebrafish as a Model System

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or cognitive impairment. We have modified and developed a three-chamber choice cognitive task similar to that used with rodents for use with hyperglycemic zebrafish. The testing chamber consists of a centrally located starting chamber and two choice compartments on either side, with a shoal of conspecifics used as the reward. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task at least 8 weeks later. Our data indicate that zebrafish respond robustly to this reward, and we have identified cognitive deficits in hyperglycemic fish after 4 weeks of treatment. This behavioral assay may also be applicable to other studies related to cognition and memory.

We present a behavioral chamber designed to assess cognitive performance. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task 8 weeks later. We also show that hyperglycemic zebrafish have altered cognitive performance, indicating that this paradigm is applicable to studies assessing cognition and memory.

La tarea de comportamiento de elección de tres cámaras utilizando el pez cebra como sistema modelo

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or ...

Modeling Fetal Alcohol Spectrum Disorders in Zebrafish to Characterize the Impact of an Adverse Embryonic Environment on Adult Social Behavior

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, and cognitive abnormalities are associated with FASD. Social difficulties are common behavioral abnormalities associated with FASD and often result in serious health issues. Animal models are critical to understanding the mechanisms responsible for ethanol-induced social defects. Zebrafish are social vertebrates that produce externally fertilized transparent eggs; these characteristics provide researchers with a precise yet simple procedure for creating the FASD phenotype and an innate behavior that can be leveraged to model the social deficits associated with FASD. Thus, zebrafish are ideal for characterizing the social deficits of FASD. The goal of the current protocol is to provide the user with a simple behavioral assay that can be used to characterize the consequences of a negative environment early during development and the effects it can have on social behavior in adulthood. The protocol can be used to characterize the effect mutations or teratogens have on adult social behavior. The protocol outlined here demonstrates how to characterize the social behavior of individual fish during a 20-min social assay. Furthermore, the data obtained using the current protocol provides evidence that the protocol can be used to characterize the effects of embryonic ethanol-induced social defects in adult zebrafish.

The goal of the current protocol is to outline the steps necessary to establish and use a social preference assay for adult zebrafish and demonstrate that it can be used to characterize ethanol-induced social defects.

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

Análisis conductual y fisiológico en un modelo de epilepsia de pez cebra

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The presented automatic video tracking system accomplishes this by using a mirror system and a calibration procedure that corrects for the considerable error introduced by the transition of light from water to air. With this system it is possible to record both single and groups of adult zebrafish. Before use, the system has to be calibrated. The system consists of three modules: Recording, Path Reconstruction, and Data Processing. The step-by-step protocols for calibration and using the three modules are presented. Depending on the experimental setup, the system can be used for testing neophobia, white aversion, social cohesion, motor impairments, novel object exploration etc. It is especially promising as a first-step tool to study the effects of drugs or mutations on basic behavioral patterns. The system provides information about vertical and horizontal distribution of the zebrafish, about the xyz-components of kinematic parameters (such as locomotion, velocity, acceleration, and turning angle) and it provides the data necessary to calculate parameters for social cohesions when testing shoals.

The use of a 3D automatic video system that can track individual and groups of zebrafish is described. As application example we explore the effects of the NMDA-receptor antagonist MK-801 on shoals of zebrafish.

El uso de un sistema de seguimiento 3D Automatizado de Registro Individual y bajíos de adultos de pez cebra

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Batería de pruebas de comportamiento para evaluar los efectos neurotóxicos en el pez cebra adulto

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Autor destacado: Evaluación de los cambios de comportamiento ambientales e inducidos por drogas en el pez cebra adulto 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.