La estabilidad de almacenamiento de vesículas celulares adicionales es un parámetro importante para su uso terapéutico prospectivo. Nuestro protocolo proporciona una herramienta fácilmente aplicable para evaluar cómo el almacenamiento afecta a las vesículas. La principal ventaja de nuestra técnica es que al introducir la glucuronidasa como un marcador exógeno, vesículas extracelulares derivadas de diferentes células madre y fácilmente comparadas con respecto a su capacidad de almacenamiento.
La fraccionamiento del flujo de flujo asimétrico, o AF4, es una alternativa suave a la purificación de cromatografía de exclusión de tamaño para compuestos muy sensibles. Porque los compuestos encuentran menos estrés en el canal. Como la glucuronidasa es una enzima sensible, la calidad de la reside reside se beneficia de una planificación exhaustiva y la realización de los pasos para la purificación y el análisis espalda con espalda.
Después de cultivar la línea celular de interés de acuerdo con las condiciones estándar para esas células, reemplace el sobrenadante con el medio de vesícula celular extra o libre de suero y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 24 a 72 horas adicionales. Al final de la incubación, recoger el súper natant de cada matraz y centrifugar las muestras para sedimentar las células. Recoja cuidadosamente el medio acondicionado de la célula sin alterar el pellet.
Y centrifugar el medio de nuevo para eliminar los desechos celulares y los agregados grandes. A continuación, transfiera cuidadosamente los sobrenadantes a tubos de ultracentrífuga. Si utiliza un rotor de ángulo fijo, marque la orientación de los tubos en la centrífuga para facilitar la recuperación del pellet de vesícula extracelular después de la centrifugación.
Al final de la ultracentrifugación, utilice una pipeta serológica para desechar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet de vesícula extracelular. A 200 microlitros de 0,2 micrómetros poro filtrado PBS al sobrenadante residual del primer tubo de ultracentrífuga. Después de resuspender el pellet, transfiera la suspensión de vesícula extracelular resultante al siguiente tubo para la resuspensión del pellet posterior hasta que todos los pellets de vesícula extracelular hayan sido resuspendidos.
Añadir beta glucuronidasa a la solución final de pellet resuspendido a una concentración final de 1,5 miligramos por mililitro. Y saponina a una concentración final de 0,1 miligramos por mililitro. A continuación, mezcle bien por vórtices durante tres segundos y coloque la reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos con un movimiento suave intermitente.
Una vez encapsulada la glucuronidasa, asegúrese de realizar todos los pasos posteriores de evaluación de la vesícula de purificación el mismo día para obtener resultados de estabilidad de almacenamiento imparciales. Tener una columna de cromatografía de exclusión de tamaño equilibrada con al menos dos volúmenes de columna de PBS listos para purificar el pellet inmediatamente después de la incubación de la saponina. Para purificar, agregue hasta 400 microlitros de vesícula extracelular de suspensión a la columna.
A continuación, recoja fracciones de mililitro del eluido. Para ajustar la separación de las vesículas extracelulares de las proteínas contaminantes y la glucuronidasa libre, mida la concentración de proteínas mediante ensayo de ácido bicinchoninico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilizando parámetros optimizados para el instrumento y el tipo de vesícula respectivos, utilice un instrumento de análisis de seguimiento de nano partículas para medir el tamaño y la concentración de la vesícula extracelular.
Para medir la actividad de la glucuronidasa, añadir 25 microlitros de fluoresina recién preparada di-beta-D-glucurónida a 125 microlitros de las vesículas extracelulares purificadas y añadir la muestra a un pozo de una placa negra de 96 pozos. Mida el tiempo de producción de fluorescina cero en un lector de placas a una excitación de 480 nanómetros y una emisión de 516 nanómetros. Cubra la placa firmemente con papel de plástico transparente para reducir la evaporación.
Luego incubar la placa protegida de la luz durante 18 horas a 37 grados Celsius. Mida la producción de fluorescina de 18 horas en el lector de placas como se acaba de demostrar. Para la liofilización de vesícula extracelular, agregue cuatro miligramos por mililitro de trehalosa a las vesículas purificadas.
Y congela las vesículas a menos 80 grados Centígrados durante al menos una hora. Para liofilizar las muestras, ajuste la temperatura del estante de un liofilizador a 15 grados celsius y la presión en 0.180 milibares. Seque las vesículas en estas condiciones durante 46 horas.
Al final de la etapa de secado principal, ajuste la temperatura del estante a 25 grados celsius y la presión a 0035 milibares y seque las muestras durante dos horas en estas condiciones. A continuación, almacene las muestras liofilizadas a cuatro grados centígrados. Para rehidratar las muestras después del almacenamiento, añada un volumen de agua igual al volumen de la suspensión de vesícula extracelular antes de la liofilización.
Para evaluar la actividad enzimática después del almacenamiento, cargue un instrumento AF4 con PBS filtrado de 0,1 micrómetros recién preparado para la fase móvil e inserte una membrana de filtro de 0,1 micrómetros en el filtro de entrada pico después de la bomba para reducir el ruido de partículas del disolvente. Después de desmontar, limpie el canal pequeño para AF4 con agua millEq. Hidrata una nueva membrana de celulosa regenerada con un peso molecular cortado de 30 kilodaltons y coloca la membrana encima del traste con el lado brillante hacia arriba.
Coloque un espaciador ancho de 350 micrómetros debajo de la mitad superior del canal y ensamble las partes del canal. Usando un destornillador de par, apriete los tornillos primero a un par de cinco metros Newton, luego a un par de siete metros Newton. Apriete los tornillos alrededor del bloque en un patrón entrecruzado.
Conecte los canales de entrada, salida y puerto de flujo cruzado al eclipse. Luego, a partir de al menos tres muestras viejas para equilibrar la membrana. Programe una ejecución de fraccionamiento con el flujo de flujo y enfoque del detector establecido en un mililitro por minuto y un flujo de inyección de 0,2 mililitros por minuto.
Después de un paso de preenfoco de un minuto, inyecte la muestra durante un período de 10 minutos en el paso de enfoque e inyección, antes de disminuir el flujo cruzado de dos mililitros por minuto a 0,1 mililitros por minuto en el transcurso de ocho minutos. Terminar la carrera de fraccionamiento con un paso de elución sin flujo cruzado durante 10 minutos y añadir un paso de lavado de elución e inyección, seguido de una elución. A continuación, equilibre el canal para la siguiente ejecución con un flujo cruzado inicial de dos mililitros por minuto y ajuste el detector UV a 280 nanómetros.
Cuando se hayan configurado todos los programas, inyecte 300 microlitros de la muestra y registre las señales de dispersión UV y de luz en el software ASTRA. Después de 12 minutos y medio, comience a recoger fracciones de mililitro hasta 27 minutos después de la inyección. A continuación, realice un ensayo de glucuronidasa y un análisis de seguimiento de nanopartículas como se ha demostrado.
Aquí, la recuperación de partículas y el tamaño de las vesículas extracelulares aisladas de las células endoteliales vasculares humanas después de siete días de almacenamiento en diferentes condiciones se muestran en comparación con una nueva muestra. Las vesículas fueron posteriormente sometidas a purificación AF4 y se midió la actividad de la glucuronidasa por partícula. Tanto la cromatografía de exclusión de tamaño como AF4 tienen éxito en la separación de la vesícula extracelular de la glucuronidasa libre.
Debido al mayor grado de separación de AF4 entre las partículas y la enzima libre, la contaminación de las fracciones que contienen vesículas es menos probable. La purificación AF4 después del almacenamiento elimina la enzima libre de las muestras y, por lo tanto, reduce la cantidad de actividad enzimática recuperada por partícula. Este efecto es más prominente después del almacenamiento en cuatro grados celsius, para lo cual se observa una reducción de 2/3.
Omitir este paso de purificación adicional puede conducir a una suposición incorrecta sobre la estabilidad de la enzima. La microscopía electrónica de transmisión no revela grandes diferencias en la forma de las vesículas extracelulares liofilizadas sin un crioprotector. El escaneo de imágenes de microscopía electrónica, sin embargo, revela la presencia de agregados dentro de las muestras liofilizadas que no se encuentran en las muestras almacenadas de menos 80 grados.
Es crucial que la enzima libre se elimine de las vesículas antes del ensayo de glucuronidasa. Por lo tanto, la técnica utilizada para la purificación de vesículas debe evaluarse a fondo. Las partículas purificadas también se podían examinar en términos de su carga superficial para averiguar si el almacenamiento cambió la composición natural de las proteínas de membrana o azúcares.
Con nuestra técnica, es posible obtener una primera indicación sobre la estabilidad del almacenamiento de vesícula extracelular, incluso cuando no hay marcadores o ensayos específicos conocidos para la actividad disponible.
