El estudio de las interacciones proteína-proteína proporciona una comprensión de la regulación de muchos procesos biológicos. Aquí demostramos un procedimiento descrito inicialmente por Y John shoe and co. Trabajadores en 2007, donde los autores han utilizado BiFC en combinación con FRET para validar la interacción tripartita entre tres moléculas de proteínas.
Sin embargo, hemos incluido mediciones de la vida útil de la fluorescencia en este procedimiento para corroborar las mediciones de FRET. Para demostrar una interacción tripartita, hemos elegido una proteína, que se sabe homodimerizar. Además, también se ha validado internamente para interactuar con un sensor de calcio de proteína conocido como proteína C en este protocolo.
Las proteínas MNC interactúan en el citoplasma. En esta técnica, dos proteínas se etiquetan con proteínas YFP divididas. Su interacción resulta en la restitución de YFP funcional que actúan como un aceptor de FRET para el tercer socio que interactúa, que se etiqueta con CFP que actúa como donante de FRET.
Comenzar con la amplificación de las secuencias codificantes de los genes de interés que son genes M y C en nuestro caso mediante PCR y clonarlos en vectores de entrada apropiados. Validar clones que se seleccionan en los antibióticos que contienen placas por digestión de restricción y secuenciación de ADN. Movilizar los CDS reconstituidos de los clones de entrada a los vectores de destino.
Todos los vectores utilizados en este experimento se enumeran en la tabla uno. Finalmente, transformar las células de agrobacterium GV3101 con los vectores de destino por electroporación. Aquí cultivamos plantas de Nicotiana Benthamiana todavía de cuatro a seis salen de etapa en condiciones controladas en una cámara de cultivo.
Prepare la mezcla de suelo mezclando soilrita, turba de coco y compost en una proporción de 2: 1: 1. Extienda una capa de una pulgada de espesor de esta mezcla en una bandeja de plástico para hacer el lecho de tierra y saturarlo con un poco de agua. Espolvoree alrededor de 200 semillas sobre el suelo y transfiéralo a una bandeja más grande que aproximadamente un centímetro de agua estancada.
Cubra esta bandeja con una envoltura de plástico para crear una cámara de humedad. Transfiera esta bandeja a una cámara de cultivo a 23 grados centígrados con 16 horas de luz y ocho horas de ciclo oscuro. Después de dos semanas, transfiera las plántulas jóvenes a macetas pequeñas de tres a cuatro pulgadas que contengan una mezcla de suelo saturado de agua.
Coloque estas macetas en bandejas de plástico y transfiéralas a la cámara de cultivo durante cuatro semanas más. Para la agroinfiltración, las cepas bacterianas deben ser recién subcultivadas y mezcladas junto con la cepa P19 de agrobacterium en proporciones apropiadas. Comience este procedimiento inoculando cepas de agrobacterias GV3101 que contengan construcciones BiFC y FRET a partir de placas de rayas en 10 ml.
al caldo que contiene antibióticos apropiados. Además, también se inicia un cultivo de la cepa P19 de agrobacterias, que se añade para evitar el silenciamiento de los transgenes. Cubra el matraz con papel de aluminio y manténgalos en un agitador de incubadora, colóquelo a 28 grados centígrados a 170 RPM durante 16 horas.
Después del crecimiento durante la noche, transfiera 1 ml. de estos cultivos a un codo desechable para medir la densidad óptica a 600 nanómetros mediante el uso de un espectrofotómetro. Mezclar los cultivos de las cepas apropiadas de BiFC y FRET partner que contengan cepas de modo que el OD final sea de 0,5 Y el de P19 sea de 0,3 en un volumen total de 2 ml.
Para lograr estas proporciones seguimos la fórmula que se muestra en la pantalla para estos cálculos. Centrifugar los cultivos mixtos de agrobacterias a 3000G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar cuidadosamente el sobrenadante. Suspende los pellets en un 2 ml.
búfer de infiltración. Es posible que tenga que usar un mezclador de vórtice para volver a suspender las células en una suspensión celular homogénea por completo. Después de esto, incube los tubos a temperatura ambiente en la oscuridad durante tres horas.
Mientras tanto, etiquete cada maceta para la mezcla de construcción con la que se va a infiltrar. Llene una jeringa sin aguja de 1 ml. con la mezcla agrobacteriana.
Presione suave pero firmemente la punta de la jeringa hacia el lado abaxial de una hoja completamente expandida mientras apoya la hoja desde el otro lado. Empuje suavemente el émbolo hasta que la solución se llene en el área de la hoja equivalente de dos a tres veces como la de la punta de la jeringa. Infiltrar la mezcla bacteriana en hasta cuatro puntos en una hoja y repetir este procedimiento durante tres a cuatro hojas para un tipo de infiltración.
Además, incluya al menos dos plantas por construcción para la infiltración. Recuerde limpiarse las manos con alcohol al 70% o cambiarse los guantes para evitar cualquier contaminación cruzada. Transfiera todas las macetas a una bandeja e incube en la cámara de crecimiento en la misma condición de crecimiento.
Revise una pequeña parte de la hoja agroinfiltrada con un microscopio de fluorescencia. Cuando la fluorescencia tanto de YFP como de CFP son detectables en las células, proceda al microscopio confocal para el ensayo BiFC FRET-FLIM. En nuestro caso, este análisis se realizó tres días después de la agroinfiltración.
Ahora que las plantas están listas para ser visualizadas bajo un microscopio, corte muestras de hojas cuadradas de cinco a 8 mm. de distancia de la punta de la jeringa enrollada y móntelas en agua destilada. Coloque un resbalón de cubierta limpia sobre él y selle.
Visualice estas muestras en un microscopio de barrido láser confocal. En este procedimiento, la base para determinar y cuantificar la interacción entre dos proteínas es la reducción de la vida útil de fluorescencia del socio donante fret sobre su interacción con el aceptor, que se utiliza para calcular la eficiencia de FRET. La complejidad en el caso de la interacción tripartita aumenta aún más porque el aceptor FRET en este caso no es una sola molécula, sino un par YFP BiFC dividido, que primero debe reconstituirse in vivo para convertirse en un fluoróforo aceptor FRET funcional.
Para llevar a cabo FRET-FLIM, tenemos que determinar la vida útil de fluorescencia de las moléculas donantes, primero solas y luego en presencia de un socio FRET. Abra la aplicación FLIM en el microscopio de barrido láser confocal, inicie la consola y utilice el recuento de fotones de reconocimiento de patrones para medir la vida útil de la fluorescencia. Seleccione el modo de medición estándar de conteo de todos los fotones.
Tomaremos dos tipos de plantas agroinfiltradas. Uno que tiene el gen CCFP y el otro que tiene CCFP junto con MYFP porque la interacción de la proteína M ya ha sido validada con la proteína C utilizando BiFC e Y2H, esperamos una buena eficiencia FRET con este par que interactúa. Ahora primero escaneamos la hoja agroinfiltrada CCFP y buscamos una célula que muestre buena fluorescencia CFP.
La configuración del microscopio se muestra en la pantalla. La muestra se ilumina a una potencia láser suficiente para alcanzar aproximadamente 0,1 fotones por pulso. Para muestras con intensidad de fluorescencia variable, capturaremos 50 fotogramas para recolectar fotones adecuados necesarios para la medición de la vida útil.
Como se sabe que la PPC exhibe dos vidas de fluorescencia debido a su adaptación confirmacional, alimentamos los datos utilizando un modelo de reconvolución exponencial mientras mantenemos el valor de N igual a dos. En estos ajustes, las dos vidas útiles son visibles a uno y 3,2 nanosegundos. Usaremos la vida útil más alta para todos los cálculos posteriores.
Ahora estamos listos para medir FRET entre CCFP y MYFP. Para esto usemos la muestra de hoja de la planta agroinfiltrada con CCFP y MYFP. Buscamos una célula que exprese tanto CCFP como MYFP y confirmemos sus respectivos patrones de emisión excitándolos utilizando láser de pulso completo de 40 nanómetros y láser de luz blanca de 514 nanómetros.
Después de eso, cambiamos a la consola FLIM para medir la vida útil de CFP utilizando la misma configuración que usamos anteriormente para medir la vida útil de CCFP. Pero esta vez la célula también está expresando MYFP que potencialmente puede interactuar con CCFP y causar una reducción en la vida útil de CCFP. Como hemos leído el gráfico obtenido utilizando el modelo de reconvolución exponencial N con N igual a dos, de hecho hay una disminución en la vida útil de CFP de 3,2 a 2,6 nanosegundos.
Ahora iniciamos la consola FRET en el software y calculamos la eficiencia FRET ingresando manualmente la vida útil incuestionable en la ecuación proporcionada en el software y la eficiencia FRET observada es del 56% Ahora pasemos al paso final, es decir, visualizar la interacción entre tres socios. Para ello, tomamos la muestra de hoja de una planta que fue coinfiltrada con CCFP y MYFPN con MYFPC. Escaneamos la planta de la hoja en busca de una célula que muestre cfp y fluorescencia YFP reconstituida que emana de la interacción entre dos proteínas M.
Utilizamos el mismo láser y la misma longitud de onda de emisión que se usaba anteriormente. Posteriormente, apagamos el láser de 514 nanómetros y pasamos a la consola FLIM. Si el dímero MYFP interactúa con CCFP.
Deberíamos ver una reducción en la vida útil de CCFP como se observa durante su interacción con MYFP. Sin embargo, si el CCFP no interactúa con el dímero MYFP, su vida útil de fluorescencia debe permanecer observada a 3,2 nanosegundos. Utilizando la configuración similar a la mencionada anteriormente, medimos la vida útil de la PPC en presencia de YFP reconstituida.
Ajustamos el gráfico usando el modelo de reconvolución exponencial N con un igual a dos y pasamos a la consola FRET. Y sí, hay una disminución en la vida útil de la PPC de 3,2 a 2,3 nanosegundos. Calculamos la eficiencia FRET como se describió anteriormente.
La eficiencia FRET calculada es del 55% Aquí hemos utilizado FLIM para medir la vida útil de fluorescencia del socio donante FRET en presencia y ausencia del aceptor FRET. Se esperaba una reducción en la vida útil de fluorescencia del donante si había una interacción positiva entre las dos proteínas. En caso de control positivo, eso es CCFP y MYFP.
Observamos una reducción en la vida útil de fluorescencia del donante de 3,3 a 2,5 nanosegundos y la eficiencia FRET fue del 56%Un ejercicio similar con YFP reconstituido resultó de la interacción entre dos amonómeros y proteínas C también resultó en una interacción FRET positiva que condujo a la reducción de la vida útil de fluorescencia del donante a 2,6 nanosegundos. La eficiencia FRET calculada fue de aproximadamente el 55% en este caso. La reducción en la vida útil de fluorescencia del donante FRET proporciona una fuerte evidencia de una interacción tripartita entre estas proteínas.
El protocolo descrito aquí es una herramienta poderosa para determinar las interacciones tripartitas proteína-proteína en las células vivas. Este procedimiento también puede ayudar a determinar la localización intracelular de los complejos resultantes, lo cual es importante para descifrar la función y el significado fisiológico de cualquier complejo de proteínas. En conclusión, el ensayo FRET-FLIM basado en BiFC brinda la oportunidad de estudiar y caracterizar aspectos importantes de las interacciones tripartitas de proteínas, lo que puede ser útil en estudios de interacción proteína-proteína en sistemas animales y vegetales.
