El ITSN, PI3K C2β-, y el control de vectores utilizados en este protocolo están disponibles a partir de los autores que lo soliciten para fines no comerciales solamente. Los autores desean agradecer al Dr. Chang-Deng, Hu por la amabilidad de prestar asesoramiento y los reactivos utilizados en el establecimiento del protocolo BiFC en el laboratorio O&#39;Bryan. KAW fue apoyado por fondos de la Fundación Jerome Lejeune. Trabajo en el laboratorio O&#39;Bryan es apoyado por subvenciones del NIH (HL090651), DOD (PR080428), la Fundación San Baldrick, y la Fundación Jerome Lejeune.

A. BiFC calibración <ol><li> Elegir un fluoróforo. Hay varios fluoróforos, como YFP y Venus, que funcionan bien como BiFC socios de la fusión (Tabla 1). Extremos amino y carboxi-terminal de Venus son capaces de formar un complejo a 37 ° C, mientras que los fragmentos YFP BiFC requieren un pre-incubación a 30 ° C con el fin de facilitar la formación del fluoróforo 2. Esta incubación a una temperatura baja puede alterar algunos procesos celulares y se debe tomar en cuenta al elegir los fragmentos. Los vectores de la fusión de Venus con el extremo carboxilo de las proteínas están disponibles en Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a> ; seepBiFC-VN173 y pBiFC VC155-), junto con construcciones adicionales para su uso como controles, por ejemplo, <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> y pBiFC bFosVC155-2. Vectores adicionales, incluyendo amino-terminal de vectores de Venus (PFLAG-VN173 y PHA-VC155), están disponibles en la siguiente dirección: <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/ hu1 ~ /</a> . </li><li> Etiqueta de la proteína de interés. Los fragmentos BiFC se funden en los extremos amino o carboxi-terminal de las proteínas candidato. Algunas proteínas no puede permitir que para el etiquetado en los extremos debido a la interrupción de la función de la proteína. Por ejemplo, muchos miembros de la superfamilia Ras de GTPasas son de lípidos modificados en el archivo adjunto carboxi impidiendo así de los fragmentos BiFC en ese extremo. Por lo tanto, es importante tener una idea de cómo la unión de los fragmentos BiFC puede afectar la función de las proteínas de interés. Si no está claro cómo el etiquetado de una proteína que afecta a su función de múltiples combinaciones deben ser probados. Además de los fragmentos BiFC, un péptido se pueden incluir para aumentar la flexibilidad entre el fluoróforo fragmentado y las proteínas candidato. Mientras que los sitios de clonación múltiple (MCS) en los vectores BiFC codificar corta tramos de aminoácidos que pueden proporcionar la suficiente flexibilidad, la RSIAT, KQKVMNH, y enlazadores RPACKIPNDLKQKVMNH han utilizado con éxito en experimentos BiFC 3,9 </li><li> Determinar las condiciones de transfección. Antes de probar varios mutantes, un control de los experimentos se deben realizar unos cuantos. Las dos primeras combinaciones BiFC que debería ser juzgado dos proteínas de tipo salvaje que se sabe que interactúan y un tipo salvaje y mutante que no interactúan. El uso de estas dos combinaciones, diferentes cantidades de ADN y los tiempos de la transfección debe ser probado para determinar las condiciones óptimas para la detección de una señal BiFC de las proteínas candidato. Le sugerimos probar 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug de cada construcción BiFC de un solo pozo de una placa de 6 pocillos. El día después de la transfección las células seguimiento por microscopía de fluorescencia para determinar el tiempo óptimo para el desarrollo de la señal. El <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> y pBiFC-bFosVC155 construye dos son útiles los controles positivos en BiFC y están disponibles en Addgene (ver arriba). Además, el análisis de Western blot se debe realizar para confirmar la expresión de la igualdad de las construcciones. Las condiciones deben ser escogidos de tal manera que una señal fluorescente que se observa entre las dos proteínas de tipo salvaje, pero muy poca o ninguna señal de que se observa entre el tipo salvaje y las proteínas mutantes. Por último, lo mejor es mantener la expresión de proteínas lo más baja posible para evitar cualquier interacción no específica. </li><li> Determinar si la adición de los fragmentos BiFC altera la localización de las proteínas de interés. Cada construcción BiFC contiene ya sea un HA o etiqueta de epítopo FLAG. Inmunotinción transefected células, tanto para el HA o etiqueta de epítopo FLAG, así como también la proteína endógena (si es posible) para determinar si la etiqueta BiFC afecta a la localización de las proteínas de interés. </li></ol> B. Revestimiento y transfección de células <ol><li> Las células COS (1.3x10 5) se colocan cada uno en un fondo de la placa de vidrio Matek y dos pocillos de una placa de 6 pocillos por muestra. Permiten a las células reposar toda la noche a 37 ° C. Otros tipos de células que son más relevantes para las proteínas candidatas de interés también puede ser utilizado. </li><li> Prepare las autoridades nacionales designadas para la transfección. Por lo general utilizan Lipofectamine (Invitrogen) para transfecciones COS. Sin embargo, otros reactivos pueden ser más apropiados para la línea celular de interés. Dado que la mezcla de transfección se dividirá entre un plato con fondo de cristal y dos pocillos de una placa de 6 pocillos, use la cantidad apropiada de ADN para dar cuenta de esta división. Diluir el ADN en 250uL de suero libre (SF) DMEM. Añadir PPC a 1 / 5 la cantidad total de ADN BiFC como control de transfección. Para la cuantificación BiFC, sólo las células que son positivas para el PPC será analizada para detectar la presencia de una señal de BiFC. Tenga en cuenta que el espectro de la PPC se solapará con algunos de los pares BiFC en la Tabla 1, por lo tanto un control de transfección alternativotal vez sea necesario. Diluir Lipofectamine en 250uL SF DMEM (10 ul Lipofectamine/1ug de ADN). Mezcla el ADN y las diluciones Lipofectamine. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Nota: El Lipofectamine: relación de ADN puede variar dependiendo del tipo de célula. Utilice el método apropiado para la transfección de la línea celular de interés. </li><li> Enjuague con agua tibia células 2x DMEM SF. Añadir 2 ml de SF DMEM a cada plato con fondo de cristal o bien de un plato de 6 pocillos. </li><li> Dividir cada mezcla de transfección en partes iguales entre un plato con fondo de cristal y dos pozos de una placa de 6 pocillos. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante 5h. </li><li> Retire el medio de transfección y reemplazar con los medios de comunicación completo (DMEM +10% FBS). </li><li> Las células se incuban durante la noche a 37 ° C. La longitud de la transfección después de incubación puede variar en función de los niveles de expresión de las proteínas de interés. Incubación prolongado puede resultar en la no interacción específica con lo que este paso tendrá que ser determinada empíricamente. </li></ol> C. Preparación de las células de la Imagen <ol><li> Las células son inicialmente examinados con un microscopio de epifluorescencia para asegurar que el control positivo es fluorescente. Si no, puede ser necesario para dar tiempo a otras células a 37 ° C hasta que la señal que se observa. </li><li> Enjuague las células 3 veces con PBS (pH 7,4). A las células en el plato con fondo de cristal añadir paraformaldehído al 2% (pH 7,4). Fijar las células durante 10 minutos en hielo. Enjuague las células 3 veces con PBS (pH 7,4). Las células se almacenan a 4 ° C cubierto con 1 ml de PBS (pH 7,4). Las células no tienen que ser fijos para las imágenes, pero una vez que los fragmentos de la reforma BiFC un fluoróforo intacta es irreversible lo que impide el análisis de las interacciones dinámicas 3. Además, tenga en cuenta que las células no fijadas continuará desarrollando la señal. Lisis de las células en la placa de 6 pocillos y se preparan lisados ​​de Western blot. Es importante que todas las células están dispuestas en el mismo tiempo para que las células lisadas son representativos de las células de imágenes. </li></ol> D. Las células de imagen <ol><li> La intensidad de la fluorescencia se calculará por celda. Asegúrese de que las células individuales de la imagen. </li><li> PPC se incluyó como un control tranfection y sólo las células positivas PPC son seleccionados para el análisis de las señales de BiFC. Hacemos la suposición de que si la célula es transfectada con la PPC, también es transfectadas con las construcciones BiFC. Este enfoque asegura que las células de imágenes que carecen de una señal de BiFC son negativos debido a la falta de una interacción entre las proteínas de interés, y no debido a la ausencia de uno o dos construcciones de expresión BiFC en esa celda. </li><li> Utilizamos un Zeiss LSM 510 microscopio confocal de imágenes de células. Cuando se usa este microscopio es importante para mantener el zoom, diafragma, ganancia del detector, el amplificador de compensación, tamaño, velocidad de exploración, el promedio de exploración, y la potencia del láser coherente. Al utilizar cualquier sistema de imagen es importante para mantener la configuración constante, de modo que la fluorescencia es comparable entre las muestras. Además, la hora de cuantificar la fluorescencia es importante que los píxeles no están saturados. </li></ol> E. Cuantificación de fluorescencia <ol><li> Fluorescencia puede cuantificarse utilizando cualquier software de imágenes. Utilizamos ImageJ que está disponible gratuitamente desde el NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Abrir archivos de imagen en ImageJ. Ir a mediciones AnalyzeSet. Marque las casillas para el área y el valor medio gris en el cuadro de medidas. </li><li> Utilizando la herramienta de &quot;selección de manos libres&quot;, dibujar un contorno alrededor del borde de la célula entera en el canal de la PPC. </li><li> Salir de este esquema en su lugar, el cambio en el canal de YFP. Ir al AnalyzeMeasure. El valor de gris medio es la suma de los valores de gris de todos los píxeles de la selección, dividido por el número de píxeles (es decir, la intensidad media de fluorescencia por área de la célula). </li><li> Para cada imagen dibujar un círculo en el canal de YFP en un área que no contiene una célula. Tomar una medida para esta zona como fondo. Resta el fondo de cada imagen. </li><li> La media del valor medio gris menos los antecedentes de todas las células de imágenes en una muestra. Esta será la intensidad media de fluorescencia para una población de células. Le sugerimos unos 60 células en tres experimentos se cuantificó. </li></ol> F. Representante Resultados: Nuestro laboratorio se centra en el andamio de proteínas con varios dominios, Intersectin (ITSN) que interactúa con numerosas proteínas que regulan múltiples procesos bioquímicos y de señalización 10,11,12,13,14. ITSN contiene dos Eps15 homología (EH) dominios, una región en espiral-espiral y cinco homología Src 3 (SH3) dominios. La isoforma más larga de ITSN también contiene homología Dbl (DH) y pleckstrin homología (PH) dominios que actúan en conjunto como un factor de intercambio de nucleótidos guanina de Cdc42 15. Esta estructura modular promueve la proteína: proteína y hace ITSN un candidato ideal para experimentos BiFC. La localización subcelular de ITSN puede alterar sus socios vinculante y por lo tanto alterar las vías reguladas por ITSN (unpublished de datos). Recientemente, nuestro laboratorio ha demostrado que ITSN regula la supervivencia neuronal a través de la regulación de una novela de PI3K de clase II, PI3K-C2β 11. El amino-terminal pro-rico dominio de la PI3K-C2β contiene dos sitios de unión para SH3 ITSN sus dominios. El uso de co-inmunoprecipitación con ITSN y PI3K-C2β mutantes de truncamiento se demostró que SH3A ITSN y dominios SH3C interactuar con la región amino-terminal de la PI3K-C2β. A continuación, se utiliza para visualizar BiFC la localización subcelular de este complejo. ITSN se fusionó con la amino-terminal de Venus (PFLAG-VN173) y construye PI3K-C2β fusionado con el carboxilo terminal de Venus (PHA-VC155). Como otro control negativo, un péptido no específicos se fusionó con PHA-VC155. VN-ITSN y VC-PI3K C2β formado un complejo BiFC con una distribución de puntuar (Figura 2A, paneles superiores). Las mutaciones en el dominio de Pro-ricos de la PI3K-C2β que interrumpir la co-precipitación de ITSN y PI3K C2β-disminución de la señal BiFC (Figura 2A, paneles inferiores) 11. Esta diferencia en la señal de BiFC entre ITSN y las dos proteínas C2β PI3K-no se debió a diferencias en la expresión de la proteína (Figura 2B). <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="Figura 1" /> . Figura 1 En BiFC, un fluoróforo (en este caso Venus) se divide en aminoácidos (VN) - y carboxi (VC) termina-terminal. Estos extremos se fusionan dos proteínas de interés. Cuando las dos proteínas interactúan, los fragmentos de VN y VC volver a asociar resultantes de una reconstitución del fluoróforo y la fluorescencia en los sitios de interacción. BiFC es un ejemplo específico de la proteína de ensayo de complementación de fragmentos (PCA) que se utiliza para medir la proteína: las interacciones proteína 5. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. ITSN y PI3K-C2β formar un complejo BiFC. A. VN-etiquetados ITSN fue co-transfectadas con el VC-etiquetados PI3K-C3β WT o un dominio rico en prolina mutante (PI3K-C2β-PA). ITSN y forma PESO PI3K-C2β un complejo (verde). PPC (rojo) se utilizó como control de transfección B. se llevó a cabo un Western blot para demostrar la expresión de la igualdad de las construcciones. El VC-etiquetados construcciones se HA etiquetados. <img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="Tabla 1" /> Tabla 1. Existen varios vectores que son compatibles con BiFC. YN155: 1-155aa de YFP, YC155: 155 238aa de YFP, YN173: 1-172aa de YFP, YC173, 173-238aa de YFP, VN155: 1-154aa de Venus; VC155: 155-238 de Venus; VN173: 1-172aa de Venus; VC173: 173-238aa de Venus; CN155 1-154aa de la PPC; CC155 155 238aa de la PPC, GN173: 1-172aa de la GFP, CitN155: 1-155aa de citrino, CitC155: 155 238aa de citrino, CitN173: 1-172aa de citrino, CitC173: 173-238aa de citrino, CerN173: 1-172aa de Cerulean 2,3,9.

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET.">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li></ol>

BiFC es un excelente método para la visualización de proteínas: las interacciones de proteínas en células enteras y la determinación de la localización subcelular de estos complejos. Las ventajas de BiFC es que sólo las proteínas que interactúan son fluorescentes, las interacciones transitorias se han estabilizado, y post-tratamiento de los datos de imagen es mínima. Dos desventajas de este método son el tiempo de maduración para el fluoróforo y la irreversibilidad de la compleja fluoróforo. En algunas ap...

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>35-011-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Bottom Microwell dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matek</td>
<td>P35G-1.5-14C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>35-3846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18324020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>21-031-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>LSM510 META</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation

La definición de la distribución subcelular de los complejos de señalización es imprescindible para entender el resultado de ese complejo. Los métodos convencionales, tales como la inmunoprecipitación no proporcionan información sobre la localización espacial de los complejos. Por el contrario, BiFC supervisa la interacción y la compartimentación subcelular de los complejos de proteínas. En este método, una proteína fluororescent se divide en amino-y carboxi-terminal no fluorescente fragmentos que se fusionan dos proteínas de interés. La interacción de los resultados de las proteínas en la reconstitución del fluoróforo (Figura 1) 1,2. Una limitación de BiFC es que una vez que el fluoróforo fragmentada se reconstituye el complejo es irreversible 3. Esta limitación es una ventaja en la detección de interacciones transitorias o débil, pero se opone a un análisis cinético de la compleja dinámica. Una advertencia adicional es que el flourophore reconstituido requiere 30 minutos para madurar y fluorescentes, una vez más se opone a la observación de las interacciones en tiempo real 4. BiFC es un ejemplo específico de la proteína de ensayo de complementación de fragmentos (PCA), que emplea las proteínas reportero como el verde variantes de la proteína fluorescente (BiFC), la dihidrofolato reductasa, b-lactamasa, y luciferasa para medir las proteínas: las interacciones proteína 5,6. Métodos alternativos para el estudio de proteínas: las interacciones de proteínas en las células incluyen fluorescencia co-localización y transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) 7. De co-localización, dos proteínas son etiquetados individualmente, ya sea directamente con un fluoróforo o por inmunofluorescencia indirecta. Sin embargo, este enfoque lleva a un segundo plano alto de la no interacción de proteínas por lo que es difícil de interpretar co-localización de los datos. Además, debido a los límites de la resolución de la microscopía confocal, dos proteínas pueden aparecer co-localizados sin necesidad de interactuar. Con BiFC, la fluorescencia sólo se observa cuando las dos proteínas de interés interactúan. FRET es otro método excelente para el estudio de las proteínas: las interacciones proteína, pero puede ser técnicamente difícil. FRET experimentos requieren el donante y el receptor a ser un brillo similar y la estequiometría de la célula. Además, uno debe tener en cuenta para sangrar a través de los donantes en el canal aceptor y viceversa. A diferencia de FRET, BiFC tiene pocos antecedentes de procesamiento de fluorescencia, poco después de los datos de imagen, no requiere de la sobreexpresión de alta, y puede detectar interacciones débiles o transitoria. Bioluminiscencia la transferencia de energía de resonancia (BRET) es un método similar al FRET salvo que el donante es una enzima (luciferasa, por ejemplo) que cataliza un sustrato para ser bioluminiscentes lo emocionante aceptador. BRET carece de los problemas técnicos de la sangre a través de la fluorescencia de fondo y alto, pero carece de la capacidad de proporcionar la información espacial, debido a la falta de localización del sustrato a compartimentos específicos 8. En general, BiFC es un excelente método para visualizar la localización subcelular de los complejos de proteínas para profundizar en la señalización en compartimientos.

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Bimolecular Fluorescence Complementation

La localización subcelular de las proteínas es importante para determinar la regulación espacio-temporal de la señalización celular. Aquí se describe la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) como un método sencillo para el control de la interacción espacial de las proteínas en la célula.

Fluorescencia de Complementación bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Research

JoVE Journal

Biology

27.7K vistas.  University of Illinois at Chicago. La localización subcelular de las proteínas es importante para determinar la regulación espacio-temporal de la señalización celular. Aquí se describe la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) como un método sencillo para el control de la interacción espacial de las proteínas en la célula.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Investigación

Biología

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular complementación de fluorescencia (BiFC) Ensayo de interacción proteína-proteína en las células de cebolla con la pistola de genes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Microbes typically live in communities. The spatial organization of cells within a community is believed to impact the survival and function of the community1. Optical sectioning techniques, including confocal and two-photon microscopy, have proven useful for observing spatial organization of bacterial and archaeal communities2,3. A combination of confocal imaging and physical sectioning of yeast colonies has revealed internal organization of cells4. However, direct optical sectioning using confocal or two-photon microscopy has been only able to reach a few cell layers deep into yeast colonies. This limitation is likely because of strong scattering of light from yeast cells4.
Here, we present a method based on fixing and cryosectioning to obtain spatial distribution of fluorescent cells within Saccharomyces cerevisiae communities. We use methanol as the fixative agent to preserve the spatial distribution of cells. Fixed communities are infiltrated with OCT compound, frozen, and cryosectioned in a cryostat. Fluorescence imaging of the sections reveals the internal organization of fluorescent cells within the community.
Examples of yeast communities consisting of strains expressing red and green fluorescent proteins demonstrate the potentials of the cryosectioning method to reveal the spatial distribution of fluorescent cells as well as that of gene expression within yeast colonies2,3. Even though our focus has been on Saccharomyces cerevisiae communities, the same method can potentially be applied to examine other microbial communities.

We present a protocol for freezing and cryosectioning yeast communities to observe internal patterns of fluorescent cells. The method relies on methanol-fixing and OCT-embedding to preserve the spatial distribution of cells without inactivating fluorescent proteins within a community.

Cryosectioning Comunidades levadura para examinar los patrones de fluorescencia

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

El análisis por citometría de Complementación fluorescencia Bimolecular: A High Throughput Método cuantitativo para estudiar la interacción proteína-proteína

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genoma toda la Proteína-proteína interacción Screening por Complementación de ensayo de proteínas-fragmento (PCA) en las células vivas

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...