Este protocolo proporciona una metodología robusta para analizar los evs a nivel celular, y un enfoque práctico para la absorción eficiente de EV y el análisis de seguimiento de EV. Este método de etiquetado ev elimina la coprecipitación de EV y tinte, mejorando así las señales EV. La absorción de EV se mide mediante análisis volumétrico para distinguir los EV internalizados de los EV superficiales.
Los vehículos eléctricos son carga activa, por lo tanto, su absorción permite la transferencia de moléculas bioquímicas. Para la investigación sobre la administración de medicamentos basados en EV y la terapia contra el cáncer, esta técnica puede ser una herramienta de evaluación. La absorción de EV desempeña un papel en la comunicación intercelular y se investiga en varios campos de investigación, como la biología del cáncer, la neurociencia y la administración de medicamentos.
Este protocolo facilita potencialmente el ensayo eficiente de absorción de EV. Para el aislamiento de vesículas extracelulares, o EV, inyecte un mililitro de medios de cultivo celular preprocesados en la cámara de muestra del dispositivo microfluídico basado en nanofiltración. Para operar el dispositivo, gire el dispositivo en la máquina de hilado de sobremesa a 3000 RPM durante 10 minutos.
Después de girar, retire el líquido de la cámara de desechos mediante pipeteo o aspiración, luego repita este procedimiento dos veces para procesar dos mililitros adicionales del medio de cultivo celular. A continuación, para lavar los vehículos eléctricos aislados, inyecte un mililitro de PBS en la cámara de muestra y haga girar el dispositivo en la máquina de hilado de sobremesa. Para el etiquetado inmunofluorescente de los EV, inyecte un microgramo por mililitro del anticuerpo específico ev en el orificio de elución del dispositivo que contiene 100 microlitros de EV aislados.
Luego incube durante una hora en la oscuridad en un agitador de placas para garantizar la distribución uniforme del anticuerpo a través de la muestra. A continuación, coloque una cinta adhesiva en el orificio de elución. Inyecte un mililitro de PBS en la cámara de muestra para eliminar los anticuerpos residuales, luego haga girar el dispositivo hasta que la cámara de muestra esté vacía.
Repita el lavado inyectando otro mililitro de PBS en la cámara de muestra y haciendo girar el dispositivo como se demostró anteriormente. Después de extraer el fluido residual de la cámara, pipetee los EV marcados fluorescentemente de la cámara de membrana en un tubo ámbar o microtubo. Proteja el tubo de la luz hasta su uso.
Sembra cuatro veces 10 a la cuarta célula PC3 en un plato de 35 mililitros con un medio de mililitros. Permita que las células se adhieran durante la noche en condiciones óptimas de cultivo celular. Al día siguiente, lave las células adheridas dos veces con medios agotados de exosomas.
Después de diluir los EV marcados fluorescentemente a la concentración apropiada utilizando medios agotados por exosomas, agregue los EV diluidos a las células diana adheridas e incube durante el tiempo experimental deseado. Después de eliminar los EV no internalizados lavando las células tres veces con medios libres de exosomas, etiquete el citoplasma de las células adheridas con un microgramo por mililitro de CMTMR e incube en condiciones óptimas de cultivo celular. Para obtener imágenes de células vivas, coloque las células preparadas en la incubadora en el escenario.
Después de establecer los parámetros de imagen basados en muestras de control, determine la profundidad de las celdas objetivo y el rango de tamaño de apilamiento en la dirección Z para adquirir imágenes confocales 3D, luego configure la adquisición de imágenes en múltiples imágenes apiladas en Z de tinte específico de la celda y tinte específico ev simultáneamente. Para el procesamiento de imágenes, utilice un software de procesamiento automático de imágenes. Para crear superficies virtuales de las celdas, haga clic en Agregar nuevas superficies.
Para configurar las superficies de celda virtual, haga clic en el botón Agregar y seleccione Calidad como tipo de filtro. Umbral del valor apropiado para el límite bajo mediante inspección visual, establezca el valor máximo para el límite superior y haga clic en el botón Finalizar Siguiente, para crear los puntos virtuales de los vehículos eléctricos, haga clic en el botón Agregar nuevos puntos. En Configuración del algoritmo, seleccione Diferentes tamaños de punto y Cálculo de la distancia más corta, luego haga clic en Siguiente y seleccione Canal 1 Alexa Fluor 488 como canal de origen.
Introduzca el valor adecuado para el diámetro XY estimado en Detección de puntos y haga clic en Siguiente. Para configurar los puntos EV virtuales, haga clic en el botón Agregar y seleccione Calidad como tipo de filtro. Establezca el umbral inferior mediante una inspección visual y haga clic en Siguiente para el tipo de regiones de spot, seleccione Intensidad absoluta y, a continuación, haga clic en Siguiente.
Para calcular el umbral de la región de los puntos EV, introduzca el valor apropiado para Umbral de región mediante inspección visual. Seleccione Diámetro desde en Volumen de región y haga clic en Finalizar. Para dividir los puntos agrupados dentro de la superficie construida, haga clic en Puntos de construcción y vaya a Filtros.
A continuación, haga clic en el botón Agregar y seleccione Distancia más corta a las superficies, Superficies 1 como tipo de filtro. Después de establecer el umbral más bajo para el límite bajo y el valor apropiado para el límite superior, haga clic en el botón Duplicar sección en el nuevo Puntos. Para el recuento automático de vehículos eléctricos dentro de las celdas, haga clic en la selección Puntos construidos 1, vaya a Estadísticas y exporte el valor del Número total de puntos.
Para obtener el número de celdas, haga clic en Superficies construidas 1 y, a continuación, vaya a Estadísticas y exporte el valor de Número total de superficies desde Total. Finalmente, vaya a la pestaña Detallado en Estadísticas para exportar el volumen. Los EV aislados de medios de cultivo celular PC3 utilizando un dispositivo microfluídico basado en nanofiltración se etiquetaron con un anticuerpo específico EV conjugado con fluoro-4 y se visualizaron mediante microscopía confocal 3D.
Los EV internalizados se visualizaron como puntcta y un procesamiento individual EV.Post de estas imágenes permite la visualización y cuantificación de la internalización ev en las células. Los resultados del ensayo de captación de EV indican que el nivel de absorción de EV depende de la duración del período de incubación. El número de EV internalizados se puede normalizar al volumen de la célula receptora para determinar la tasa real de absorción de EV para la celda especificada.
Este procedimiento permite la exclusión sistemática de vehículos eléctricos no internalizados para medir con precisión el número de vehículos eléctricos internalizados. La distribución de tamaño de los puntos EV internalizados se muestra aquí. Por lo tanto, los pasos clave son la utilización del dispositivo microfluídico para el etiquetado de EV, la minimización de la fluorescencia de fondo al visualizar EV fluorescentes y luego el análisis posterior a la imagen para determinar EV internalizados versus superficiales.
Por lo tanto, el seguimiento intracelular de EV se puede realizar en tiempo real en un plano 3D, y además, se puede lograr el análisis de tráfico de EV en resoluciones espaciales / temporales y la colocalización de EV con orgánulos subcelulares. Por lo tanto, creemos que esta técnica proporciona una forma más fácil y eficiente de investigar los EV dentro de las matrices intra y extracelulares para los investigadores dentro del campo de la comunicación celular para los EV.
