Este protocolo emplea microscopía de superresolución, específicamente microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa, también conocida como dSTORM, para eludir el límite de difracción y visualizar evs con precisión nanométrica en tres dimensiones. Una ventaja notable de dSTORM es su capacidad para visualizar directamente las partículas debajo del nivel de difracción de la luz sin pasos dañinos que alteren la naturaleza bioquímica del EV. Muchos virus evolutivamente distintos emplean la señalización EV, por lo tanto, dSTORM se puede emplear para caracterizar los EV para los biomarcadores y la progresión de la enfermedad, así como para visualizar partículas de virus individuales, como el SARS-CoV2. Comience colocando vesículas extracelulares purificadas por afinidad, o EV, en placas con fondo de vidrio, microslide y ocho pocillos en un volumen total de 200 microlitros, y permita que se adhieran a la superficie durante la noche a cuatro grados centígrados.
Sin quitar la solución existente de la placa de ocho pocillos, fije los EV en las placas agregando 200 microlitros de paraformaldehído al 4% en 1X PBS a la solución que contiene EV en cada pozo y permita que las placas se incuben durante 30 minutos a temperatura ambiente. Retire cuidadosamente el paraformaldehído y el exceso de solución con una micropipeta para no molestar los EV. Lave el EV con 1X PBS para eliminar el exceso de paraformaldehído.
Realice el procedimiento de lavado tres veces. Retire el exceso de 1X PBS. Prepare 250 microlitros de solución tampón dSTORM Bcubed por muestra creando una solución de dioxigenasa protocatecúica de cinco milimolares diluida en tampón de imágenes según el protocolo del fabricante.
Agregue 250 microlitros del tampón preparado a cada pozo según el protocolo del fabricante, e incube las placas durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de obtener imágenes para eliminar las moléculas oxidantes. Los vehículos eléctricos se pueden visualizar inmediatamente o almacenar a cuatro grados centígrados durante una semana. Para preparar las perlas requeridas para la calibración del microscopio de superresolución, diluya las microesferas de 100 nanómetros a una concentración del 0,5% en agua de grado de biología molecular y pipetee 200 microlitros en cada pozo de una placa de ocho pocillos con fondo de vidrio, microslide y ocho.
Permita que las cuentas se asienten en los pozos durante una hora a temperatura ambiente. Sin quitar la solución existente, agregue 200 microlitros de paraformaldehído al 4% en PBS a cada pozo a la solución de perla de calibración, y deje incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Retire cuidadosamente el paraformaldehído con una micropipeta para no molestar las cuentas, y lave las perlas tres veces con 1X PBS.
Prepare el búfer como se describe en el manuscrito. Retire 1X PBS y agregue 250 microlitros del tampón preparado a cada pozo. Deje que el búfer permanezca durante 20 minutos antes de la visualización.
Utilice el botón Conectar el microscopio para conectarse al microscopio 3D antes de colocar cualquier cosa en el escenario. Agregue aceite 100X al objetivo y coloque el centro del pozo encima del objetivo. En la configuración Adquirir, encienda los láseres de excitación de 473 y 640 nanómetros y haga clic en Ver.
Sin activar la lente 3D, vea las cuentas debajo de la configuración de saturación de fotones haciendo clic en Recuentos de fotones en las Opciones de visualización de imágenes. Establezca las potencias iniciales del láser en 8,4 milivatios para el láser de 473 nanómetros y 11,6 milivatios para el láser de 640 nanómetros. Disminuya el enfoque del láser a alrededor de menos 300 nanómetros o el plano focal de las cuentas de calibración para producir una resolución clara de las cuentas individuales.
Una vez que el plano Z está enfocado, ajuste aún más los niveles de potencia del láser para tener en cuenta la variación en cada campo de visión. En las funciones instrumento, complete la calibración de mapeo 3D y la calibración de mapeo de canales para obtener los errores en los ejes X, Y y Z. establezca el número máximo de campos de visión en 20, el número objetivo de puntos en 4.000, la distancia máxima entre canales en 5,0 píxeles y el radio de exclusión entre canales en 10,0 píxeles durante la calibración de mapeo de canales.
Asegúrese de que la calibración produzca una cobertura de puntos superior al 90% y una calidad de mapeo que sea buena. Guarde los datos de calibración dados para futuras adquisiciones de imágenes. Agregue aceite 100X al objetivo y coloque los vehículos eléctricos preparados en el microscopio.
Sin activar la lente 3D, encienda el láser de excitación de 640 nanómetros e inicialmente elévelo a entre 1,2 y 12,5 milivatios, dependiendo de la intensidad de la señal en el campo de visión para excitar la membrana roja, intercalando los EV teñidos de tinte. En Opciones de visualización de imágenes, cambie el método de visualización de la saturación de fotones a los percentiles para visualizar mejor los vehículos eléctricos. Ajuste la potencia del láser para minimizar el ruido mientras maximiza la señal y mantiene todos los demás parámetros.
Ajuste el enfoque del plano Z haciendo clic en el icono arriba o abajo del eje Z. Establezca el tiempo de exposición en 20 milisegundos, la captura de fotogramas en 10.000 fotogramas y la potencia láser inicial entre 1,2 y 12,5 milivatios, dependiendo de la intensidad de la señal y el campo de visión. Active la lente 3D usando el icono e inicie la adquisición haciendo clic en el botón Adquirir.
A lo largo del proceso de adquisición de imágenes, aumente la potencia del láser en tres incrementos de 10 cada 1000 fotogramas, o lo suficiente como para mantener una alta relación señal-ruido. No ajuste el plano Z durante la adquisición. Después de la adquisición de la imagen, cambie a la ventana Analizar visualización.
Realice la corrección de deriva en la imagen sin filtrar y, a continuación, active los filtros. Ajuste el recuento de fotones, la precisión de localización, los sigmas y el índice de fotogramas, como se menciona en el manuscrito. Superponga una herramienta de vista de plano X, Y y Z a lo largo del eje X de vehículos eléctricos individuales desde el campo de visión y exporte los archivos csv individuales de eventos de fotoconmutación.
Diviecte vehículos eléctricos individuales en el eje X, Y en un campo de visión X por Y utilizando una herramienta Histograma de línea, que fija los eventos de fotointerruptores en grupos de distancia establecidos. Tome imágenes de vehículos eléctricos individuales y guárdelas como archivos tif. Cree videos 3D de vehículos eléctricos individuales utilizando una herramienta de visualización 3D y coloree de acuerdo con la ubicación a lo largo del eje Z.
Después de la calibración del microscopio que produjo un error promedio de 16 nanómetros en el eje X, Y y 38 nanómetros en el eje Z, los EV u20 purificados se visualizaron con éxito con una resolución de hasta 20 nanómetros en el eje X, Y y 50 nanómetros a lo largo del eje Z. Los vehículos eléctricos individuales visualizados a través de dSTORM en fotos 3D conmutaron a lo largo de la exposición de 10, 000 fotogramas a medida que aumentaba la potencia del láser, y eran fácilmente evidentes en la imagen adquirida. La corrección de la imagen posterior a la adquisición en el plano Z, los recuentos de fotones, los sigmas y la precisión de localización de la imagen reconstruida dieron como resultado una resolución clara del EV en 3D.
El EV se activó durante solo los primeros 7, 000 cuadros, como se ve en la leyenda en la esquina superior derecha. El histograma confirma que la mayoría de los eventos de fotoconmutación ocurrieron dentro de un radio de 100 nanómetros, validando que el EV visualizado es un exosoma, y que el aislamiento de EV de un diámetro pequeño fue exitoso. El análisis de distribución de tamaño realizado en otros vehículos eléctricos trazados individualmente utilizando la herramienta Histograma de línea y la herramienta X, Y, Z-plane View confirmó que la mayoría de los eventos de fotointerrupción ocurrieron dentro de un radio de 100 nanómetros del centro.
El error a lo largo del eje Z se incrementó, produciendo una imagen final alargada del EV a lo largo del eje axial. Los eventos de fotointerrupción no se correlacionaron con el tamaño del EV, lo que demuestra que la caracterización basada en dSTORM se puede usar para vehículos eléctricos pequeños como exosomas y virus pequeños envueltos de menos de 100 nanómetros de diámetro. Al realizar dSTORM, es importante recordar establecer la potencia inicial del láser muy baja y elevarla lentamente a lo largo de la adquisición de la imagen para evitar el fotoblanqueo.
Desde su desarrollo, dSTORM ha permitido a los investigadores comprender mejor la morfología de las estructuras subcelulares que antes eran imposibles de visualizar debido al límite de difracción de la microscopía de luz típica.
