Este protocolo proporciona un análisis en tiempo real de dos vías bioenergéticas principales: respiración mitocondrial y glucólisis en tejidos retinianos de ratón ex vivo recién diseccionados. El análisis tradicional de caballitos de mar se centró en células monocapas cultivadas, mientras que este protocolo permite a los investigadores estudiar la actividad mitocondrial en tejidos recién diseccionados, específicamente la retina. Esta técnica se utiliza para estudiar las actividades de las mitocondrias y las banderas de glucólisis en retinas de modelos de ratón con degeneración retiniana hereditaria.
Es una herramienta útil para la investigación de la retina y también tiene potencial para ser aplicado a otro tipo de tejido para desarrollar posibles terapias. La parte más difícil de este protocolo es obtener discos perforados de calidad de la retina de ratón recién diseccionada, por lo que se recomienda que la persona que realizará esta técnica tenga buenas habilidades de disección de la retina. El día antes del experimento, abra el cassette del cartucho del sensor y agregue un mililitro de medio de calibración a cada pozo de la placa de utilidad.
Incubar durante la noche en una incubadora libre de dióxido de carbono a 37 grados centígrados para activar los fluoróforos. El día del experimento, prepare el medio de ensayo en medicamentos compuestos diluidos de stock. Calentar el medio de ensayo en el baño de agua de 37 grados centígrados.
Configure el programa de ensayo en la máquina como se describe en el manuscrito de texto. Abra la tapa del cassette que contiene las inserciones de malla. Pipetee ocho microlitros de la mezcla de recubrimiento a cada inserto de malla, luego use una punta de pipeta para extender suavemente la gota y distribuir la mezcla de recubrimiento por igual en todo el inserto de malla.
Cierre el cassette y deje que los insertos de malla se incuben a temperatura ambiente durante al menos 25 minutos para su absorción. Después de la incubación, lave los insertos de malla pipeteando cuatro mililitros del medio de ensayo directamente sobre los insertos. Agite suavemente el cassette para asegurarse de que todos los insertos de malla se laven con el medio de ensayo.
Para preparar el golpe de retina, enucle los ojos de un ratón adulto sacrificado y colóquelos en PBS helado en una placa de Petri, luego coloque la placa de Petri bajo un microscopio de disección. Usando microscisores, corte el nervio óptico, luego retire cuidadosamente los músculos extrarrectos unidos fuera del globo ocular. Con una aguja de calibre 30, perfore un orificio en el borde de la córnea.
Luego use microescisoras de disección fina para hacer un corte circular a lo largo del borde de la córnea. Usando pinzas de disección afiladas, retire la córnea, el cristalino y el humor vítreo de la copa del ojo. Haga varios cortes pequeños en la capa escleral en el borde de la copa del ojo usando microescisores de disección fina.
Use dos fórceps de disección afilados para sujetar el tejido escleral a cada lado y tire de la capa escleral con mucho cuidado para extraerla de la retina neural. Repita esto alrededor de la copa del ojo hasta que se extirpe toda la esclerótica y se obtenga una copa de retina intacta. Haga cortes radiales en la copa de la retina para aplanarla y generar varias secciones distintas utilizando microescisores de disección.
A continuación, con un punzón de biopsia de un milímetro de diámetro, corte un disco de retina de cada sección de la copa retiniana aplanada. Golpee a una distancia igual de la cabeza del nervio óptico. Transfiera los insertos de malla pre-recubiertos en la placa de Petri de disección usando fórceps.
Con la ayuda de dos cepillos de pestañas súper finos, coloque el disco perforador de retina en el centro del inserto de malla con la capa de células ganglionares hacia abajo tocando la malla y la capa fotorreceptora hacia arriba. Para cargar el cartucho del sensor, saque el cassette de la placa del cartucho del sensor hidratado de la incubadora de 37 grados Centígrados. Después de quitar la cubierta del hidrorefuerzo, vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de servicio.
Cargue el volumen deseado de soluciones compuestas de inyección en los puertos apropiados sosteniendo la punta de la pipeta en un ángulo de 45 grados, insertando la punta de la pipeta a mitad de camino en un puerto de inyección con el bisel de la punta contra la pared opuesta del puerto de inyección. Cargue suavemente el compuesto en cada puerto. Cargue el cartucho del sensor en la máquina para su calibración haciendo clic en el botón Iniciar ejecución para abrir la bandeja de la máquina.
Coloque el cartucho del sensor en la máquina y haga clic en el botón Estoy listo para iniciar la calibración. Cargue el volumen deseado del medio de ensayo en cada pozo de la placa de captura del islote. Usando fórceps, agarre el borde del inserto de malla que contiene discos perforantes de retina y sáquelo de la placa de Petri.
Golpee ligeramente la parte inferior del inserto de malla en un pañuelo absorbente para eliminar el líquido adicional y colóquelo en el pozo de la placa de captura del islote. Repita este paso hasta que todos los insertos de malla con punzones de retina se coloquen en la placa de captura del islote llenando los pozos de corrección de fondo y los pozos en blanco con insertos de malla vacíos. Usando dos pinzas Graefe, presione el borde de cada inserto de malla con cuidado y suavidad, asegurándose de que estén insertadas de manera segura en la parte inferior de la placa de captura del islote.
Coloque la placa de captura del islote cargada en una incubadora de 37 grados Celsius durante cinco minutos para calentarse, luego expulse la placa de utilidad después de que se complete la calibración. Reemplácelo con la placa de captura del islote que contiene punzones de retina y reanude la ejecución del ensayo haciendo clic en el botón de la placa de la celda de carga. Una vez completada la ejecución, expulse el cartucho del sensor y la placa de captura del islote que contiene punzones de retina haciendo clic en el botón de expulsión, luego haga clic en el botón Listo para que los datos se guarden automáticamente como un archivo ASYR y la pantalla cambie automáticamente para mostrar el resultado.
El ensayo de estrés mitocondrial que muestra un rastro de OCR y un ensayo de tasa glucolítica que muestra tanto el rastro de OCR como el de ECAR se realizaron utilizando discos perforados de retina de un milímetro recién diseccionados. En el ensayo de estrés mitocondrial, bam15 se inyectó para desacoplar el gradiente de protones de la producción de ATP mitocondrial, lo que resultó en el aumento de OCR al nivel máximo. Se inyectaron rotenona y antimicina A para inhibir la respiración mitocondrial en el complejo uno y el complejo tres respectivamente, lo que resultó en una caída en el OCR al nivel mínimo.
La diferencia entre el nivel máximo de OCR y la última medición del nivel basal de OCR refleja la capacidad de reserva mitocondrial. En el ensayo de tasa glucolítica, la inyección de rotenona y antimicina A apaga la respiración mitocondrial e impulsa la glucólisis al alza. La glucólisis se aprovecha inyectando 2-desoxi-d-glucosa, que compite con la glucosa para la unión a la hexoquinasa, lo que hace que el ECAR caiga al nivel mínimo.
La diferencia entre el nivel máximo de glico ECAR en la última medida del nivel basal de glico ECAR refleja la capacidad de reserva de glucólisis. Para producir datos confiables, es fundamental obtener una buena calidad de los discos perforados de retina y limitar el tiempo total de disección dentro de 1.5 horas. Después del experimento, se puede cuantificar el ADN del contenido de proteínas de un disco de retina en un pozo y usarlo para normalizar los datos del caballito de mar.
Por lo tanto, este protocolo se utilizó para estudiar el desarrollo, el envejecimiento y la enfermedad en la retina. También se analizó la preferencia o dependencia tisular de diferentes sustratos de combustibles como la glucosa o los ácidos grasos.
