La spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence est une méthode statistique qui utilise la fluorescence par résultat temporel pour identifier la signature dynamique des récepteurs couplés à la protéine G dans les cellules vivantes. Ici, nous nous intéressons particulièrement aux récepteurs bêta-2 adrénergiques. Les récepteurs sphingolipides fournissent principalement des informations sur la dynamique de diffusion translationnelle et, à l’aide de l’anisotropie de fluorescence, également sur la diffusion rotationnelle.
En introduisant une étiquette supplémentaire, nous pouvons également favoriser les changements contraignants ou même conformationnels si nous favorisons le transfert d’énergie de résonance entre les étiquettes telles qu’elles ont été sondées. La fluorescence quantitative résolue dans le temps nécessite un alignement minutieux des mesures de configuration et d’étalonnage. Dans les minutes qui suivent, nous fournirons un guide expérimental pour la spectroscopie de corrélation de fluorescence des cellules de vie, la spectroscopie de corrélation croisée et le transfert d’énergie de résonance forster des récepteurs couplés aux protéines G, en utilisant des balises clonables et une force d’écoulement synthétique.
L’assise cellulaire et la transfixation doivent être effectuées dans des conditions stériles. Placez une barre de glissement de couverture propre sur une plaque de culture à six puits et lavez-la avec une solution saline tampon phosphate stérile, ajoutez deux mL de milieu de culture cellulaire avec du rouge phénolique complété par 10% de sérum bovin fœtal, 100 microgrammes, par amine pénicilline et 100 microgrammes par ml de streptomycine à chaque puits, et gardez-le de côté. Prenez les cellules CHO qui sont cultivées dans le même milieu avec du rouge phénolique à 37 degrés centigrades dans cinq pour cent de CO2 et lavez-les avec cinq mL de PBS pour éliminer les cellules mortes.
Ajouter deux mL de trypsine et incuber pendant deux minutes à température ambiante. Diluer les cellules de données avec huit mL de milieu avec du rouge phénol et mélanger soigneusement par pipetage. Comptez les cellules dans une chambre de Neubauer et asseyez-les à une densité de 150 000 cellules par puits dans la plaque de culture à six puits contenant le glissement de couverture.
Laissez les cellules se développer dans un incubateur pendant 24 heures afin d’atteindre une confluence d’environ 80%. Diluer deux microgrammes de l’ADN vecteur désiré. Par exemple, CT SNAP ou NT SNAP, et six microlitres de ce réactif de transfection dans deux tubes séparés.
Chacun contenant 500 microlitres de milieu sérique réduit pour chaque puits et les incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Mélanger les deux solutions ensemble pour obtenir le mélange de transfection et l’incuber pendant 20 minutes supplémentaires à température ambiante. En attendant, lavez les cellules CHO assises une fois avec du PBS stérile.
Remplacer le PBS par un ml par puits de milieu sans phénol rouge, complété par 10% de sérum bovin fœtal et sans antibiotiques. Ajouter tout le mélange de construction d’une goutte d’un ml à chaque puits et incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés dans cinq pour cent de CO2. Pour le étiquetage, diluer le substrat SNAP approprié dans un milieu mL complété par du sérum bovin fœtal à 10 % pour obtenir une concentration finale d’un micromolaire.
Lavez les cellules transfectées une fois avec du PBS et ajoutez un mL par puits d’une solution de substrat SNAP micromolaire. Incuber les cellules pendant 20 minutes à 37 degrés dans cinq pour cent de CO2. Lavez les cellules trois fois avec un milieu sans phénol et ajoutez deux mL par puits en milieu sans phénol rouge.
Incuber les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés centigrades dans cinq pour cent de CO2. Transférez ensuite le couvercle de tous les échantillons dans la chambre d’imagerie et lavez-le avec un tampon d’imagerie de 500 microlitres. Ajoutez un tampon d’imagerie de 500 microlitres avant de passer à la configuration FRED FCS.
La configuration FRED FCS est équipée d’un objectif d’eau de microscopie confocale, de deux lignes laser, d’un système de comptage étranger unique quilter temporel, de deux BMT hybrides et de deux actions pour la collecte de photons et le logiciel de collecte de données. Il est très important d’aligner la configuration à chaque fois avant la mesure dans les cellules vivantes. Pour régler la mise au point, le sténopé et la position de coloration, placez deux solutions d’étalonnage vert nanomolaire sur un couvercle en verre et allumez le laser de 485 nanomètres et 560 nanomètres fonctionnant en piles, en excitation entrelacée ou en mode PI.
Concentrez-vous sur la solution et ajustez la position du sténopé et de l’anneau du collier de manière à obtenir le taux de comptage le plus élevé et le plus petit volume confocal pour obtenir la luminosité moléculaire maximale. Répétez ce processus pour les canaux rouges avec une solution d’étalonnage rouge nanomolaire 10 et un mélange des deux. Placez 10 solutions d’ADN nanomolaire sur le glissement du couvercle en verre et ajustez la mise au point du sténopé et la position de l’anneau du collier de manière à ce que les couleurs croisées entre les canaux de détection vert et rouge soient les plus élevées.
C’est la source de l’amplitude la plus élevée. Pour les mesures dans les cellules vivantes, trouvez une cellule appropriée en limitant avec la lampe marqueur et en observant à travers l’oculaire. Allumez les deux lasers en mode PI et concentrez-vous sur la membrane en recherchant le nombre maximal par seconde.
Veuillez noter que la puissance du laser peut devoir être réduite pour les échantillons de cellules. De préférence moins de cinq microwatts à l’objectif. Cela dépend fortement de la fleur utilisée et de la configuration.
Observez les courbes auto et cross coll de la bêta-2 AR liée à EGP et enclenchez les sondes d’étiquettes dans l’aperçu en ligne du logiciel de collecte de données et collectez plusieurs mesures de tri avec un temps d’acquisition compris entre 60 et 180 secondes. Exportez le cours de corrélation et le contraste de toutes les mesures. Veuillez prendre soin ici de définir correctement les fenêtres d’invite et de délai et d’utiliser une option d’obtention de micro-temps dans le logiciel de corrélation de données.
Au total, trois corrélations différentes sont nécessaires. Corrélation automatique de la fenêtre de temps d’invite du canal vert. Corrélation automatique des canaux rouges et de la fenêtre de temps de retard.
Et enfin, la corrélation croisée du signal du canal vert et de la fenêtre de temps d’invite était le signal du canal rouge dans la fenêtre de temps de retard. Voici les fonctions d’auto-corrélation du FRED vert et rouge pour les solutions et les adapter à un modèle de diffusion 3 DT avec un terme triplet supplémentaire de nécessaire pour calibrer la forme et la taille du volume de détection confocale pour les deux canaux de couleur d’utilisation, où B est la ligne de base de la courbe et le nombre de molécules et de mise au point, TD le temps de diffusion et S, le zéro sur oméga zéro le facteur de forme de l’élément de volume confocal. Le clignotement du triplet et la physique de la photo sont décrits comme amplitude AR et temps de relaxation TR. Utilisez le coefficient de diffusion connu pour les étalonnages vert et rouge et obtenez des facteurs de forme pour déterminer les dimensions et le volume de l’élément de volume confocal infectieux.
Calculez le spectre comme IFR, le signal fluorescent vert collecté sur les canaux zéros, et deux dans le canal de détection droit, canal un et trois, en tant que rapport des signaux collectés en arrière-plan. Déterminer l’attente directe du flux de données de l’accepteur par les longueurs d’onde d’excitation du donneur par le rapport du contraste de fond collecté des mesures d’étalonnage rouge et l’excitation rapide de la fenêtre de temps par laser vert à l’arrière-plan compte correct directement dans l’excitation de la fenêtre de temps de retard par laser rouge. Calculer la luminosité moléculaire de B à la fois la force d’écoulement verte et rouge en fonction du contraste de fond collecté, et pour obtenir le nombre de molécules et se concentrer sur l’ajustement de diffusion 3 DT.
L’ajustement des corrélations ultra du canal vert et rouge, ainsi que de la corrélation croisée de l’invite verte et du retard rouge de l’ADN à double niveau au modèle de diffusion 3 DT maintient les facteurs de forme obtenus constants pour les fonctions de corrélation automatique. Le facteur de forme des fonctions de corrélation croisée se situe généralement entre ces deux valeurs. Déterminez l’amplitude à zéro temps de corrélation en fonction des valeurs de police du nombre apparent de molécules et de la mise au point.
Calculer le rapport d’amplitude pour un échantillon était une co-diffusion de 100% de la force du sol vert et rouge. Ajustez les échantillons de cellules à un modèle approprié. La façon dont on leur montre que la diffusion des récepteurs membranaires n’est pas curieuse de manière bimodale était un temps de diffusion court, pas long.
De plus, la physique de la photo et le clignotement de la force du sol doivent être pris en compte. Ici à TD1 et TD2, sont les deux nécessaires aux temps de diffusion. Et un est une fraction du premier temps de diffusion Contrairement à la mesure d’étalonnage dans laquelle les dés libres et la diffusion des brins d’ADN, toutes directions, les récepteurs membranaires ne montrent que la diffusion 2D le long des membranes cellulaires calculent la concentration de protéines vertes ou rouges à partir du respect du nombre de molécules et de la mise au point.
Et le volume de l’élément de volume confocal, en utilisant la masse de polarisation. Ajuster les deux corrélations alto de l’échantillon à double étiquette en utilisant le même modèle que pour la construction à un seul niveau et la fonction de corrélation croisée à l’aide d’un modèle de diffusion bimodale, Note pour une description globale du système. Les trois cultures doivent être adaptées conjointement.
Le terme de diffusion est identique pour les trois cultures. Et la seule différence est une perte de temps de réputation, la fonction de corrélation croisée. Calculez la concentration de protéines de travail vertes ou rouges à partir du nombre respectif de molécules et de foyer et du volume de l’élément de volume confocal.
Estimer la fraction ou la concentration de protéines vertes et rouges en interaction à partir des échantillons cellulaires en utilisant les facteurs de correction obtenus à partir des échantillons d’ADN, les rapports d’amplitude de l’échantillon cellulaire et les concentrations obtenues respectives. Ajuster les deux corrélations alter de l’échantillon FRED en tant qu’échantillons marqués uniques et la corrélation croisée avant à un modèle de diffusion bimodale contenant un terme anti-corrélation, où AF reflète l’amplitude de l’anticorré corrélation totale et AR et TR l’amplitude et le temps de relaxation respectifs. En cas de changements de fluorescence anti-corrélés dus à FRED, un ou plusieurs termes anti-corrélation peuvent être nécessaires, ce qui a entraîné une baisse de la fonction de corrélation croisée Fred à des moments de faible corrélation coïncidant avec une augmentation des deux fonctions d’autocorrulation.
Les mesures d’étalonnage des solutions florales vertes et rouges pour raser des facteurs de 6,5 et les canaux verts, et 6,8 dans les canaux rouges. Ainsi, le volume confocal a la taille de 1,4 et 1,9 femto plus tard ce jour de mesure, la luminosité de la molécule se situe à 12,5 kilohertz par molécule, et 2,6 kilohertz par molécule. Nous avons 15% de diaphonie de la fleur verte vers les canaux rouges après excitation du donneur et 38% de l’excitation directe sauf de la forme florale rouge par le vert, à partir de notre mesure de l’ADN, nous déterminons les facteurs de correction pour le volume de chevauchement confocal à 0,6 et 0,7 aussi, les cellules transfectées avec une construction mono-étiquette montrent une diffusion bimodale bidimensionnelle sur la membrane cellulaire où environ la moitié des molécules diffusent lentement sur l’échelle de temps de 50 à cent millisecondes et l’autre moitié relativement rapide autour de deux millisecondes dans les deux constructions.
De plus, le clignotement du triplet est présent. Cependant, dans la construction d’accrochage au niveau rouge, un autre temps de relaxation est acquis à 180 microsecondes, ce qui peut provenir d’un snap droit non lié. À partir de la double étiquette elle-même, transectée avec la construction anti-encliquetage où les deux étiquettes sur deux côtés différents de la membrane cellulaire, deux mesures de moins ont été collectées le bruit et la couche rouge sur la corrélation.
Et la corrélation croisée PI est assez élevée ici. Ici 70% des molécules, si vous êtes lentement sous une échelle de temps de cent millisecondes, et seulement 30% rapide autour d’une milliseconde, la fraction de molécules à double libération est faible et se situe entre 15 et 25%Les données pour le snap CT semblent meilleures et moins bruyantes. Cependant, l’anti-corrélation frontale la plus profonde attendue ne peut pas être vue et est très probablement la masse par la quantité élevée de diaphonie, l’excitation d’acceptation directe et le clignotement triplet des deux forces florales, et une fois que les schémas d’analyse des données tirant parti de l’intensité de fluorescence collectée DKS pourrait aider à sauver cela comme indiqué pour l’ensemble de données simulé.
L’avantage de la technique Fred FCS est qu’avec la mobilité, nous pouvons étudier la dynamique de conférence des RCPG. Cependant, l’exécution de FR FRED dans les laboratoires est difficile et demande de bonnes cellules transfectées, un étiquetage efficace et une configuration calibrée parfaite. Juste une paire FRED pro force est également très cruciale.
Les étapes expérimentales critiques comprennent l’optimisation de l’optimisation de la transfection, la minimisation de l’arrière-plan et l’autofluorescence. De plus, le pipeline d’analyse Atoms aidera à comprendre les différentes dynamiques des précepteurs dans les cellules vivantes. Nous espérons que ce protocole sera utile pour réaliser l’approche FRED FCS dans des expériences sur des cellules vivantes.
