Floresan çapraz korelasyon spektroskopisi, canlı hücrelerde G proteini bağlantılı reseptörlerin dinamik imzasını belirlemek için zaman sonucu floresan kullanan istatistiksel bir yöntemdir. Burada, özellikle beta-2 adrenerjik reseptörlerle ilgileniyoruz. Sphingolipid reseptörleri esas olarak çevirisel difüzyon dinamikleri hakkında bilgi sağlar ve floresan anizotropi yardımıyla da rotasyonel difüzyon sağlar.
Ek bir etiket sunarak, etiketler arasında problanmış olarak rezonans enerjisi transferini teşvik ederse, bağlayıcı ve hatta konformasyonsal değişiklikler de yapabiliriz. Nicel zaman çözümlenen floresan, kurulum ve kalibrasyon ölçümlerinin dikkatli bir şekilde hizalamasını gerektirir. İlerleyen dakikalarda, klonlamalı etiketler ve sentetik akış kuvveti kullanarak G proteini bağlantılı reseptörlerin yaşam hücresi floresan korelasyon spektroskopisi, çapraz korelasyon spektroskopisi ve Forster rezonans enerji transferi için deneysel bir kılavuz sunacağız.
Hücre oturma ve transfixing steril koşullarda yapılmalıdır. Altı kuyu kültür tabağına temiz bir kapak kayması halteri yerleştirin ve steril fosfat tampon salin ile yıkayın, her kuyuya% 10 fetal sığır serumu, 100 mikrogram, amin penisilin başına ve ml streptomisin başına 100 mikrogram ile desteklenmiş fenol kırmızısı ile iki mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve bir kenara saklayın. Yüzde beş CO2'de 37 derecelik derecelik fenol kırmızısı ile aynı ortamda kültürlenen CHO hücrelerini alın ve ölü hücreleri çıkarmak için beş mL PBS ile yıkayın.
İki mL tripsin ekleyin ve oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yaslayın. Veri hücrelerini sekiz mL orta ile fenol kırmızısı ile seyreltin ve pipetleme ile dikkatlice karıştırın. Bir Neubauer odasındaki hücreleri sayın ve kapak kaymasını içeren altı kuyu kültürü plakasında kuyu başına 150.000 hücre yoğunluğunda hücreleri oturtun.
Hücrelerin yaklaşık% 80 izdiah elde etmek için 24 saat boyunca bir inkübatörde büyümesine izin verin. İstenen vektör DNA'sının iki mikrogramını seyreltin. Örneğin, CT SNAP veya NT SNAP ve bu transfeksiyon reaktifinin altı mikroliteri iki ayrı tüpe dönüştürülür.
Her biri her kuyu için 500 mikroliter azaltılmış serum ortamı içerir ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırılır. Transfeksiyon karışımını elde etmek için iki çözeltiyi karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika daha kuluçkaya bırakın. Bu arada, oturulan CHO hücrelerini steril PBS ile bir kez yıkayın.
PBS'yi% 10 fetal sığır serumu ve antibiyotik içermeyen fenol kırmızısı içermeyen ortamın kuyusu başına bir ml ile değiştirin. Her kuyuya bir ml'lik damlanın tüm inşaat karışımını ekleyin ve hücreleri bir gecede yüzde beş CO2'de 37 derecede kuluçkaya yatırın. Etiketleme için, uygun SNAP substratını% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş bir mL ortamında seyrelterek bir mikromolar son konsantrasyonu elde edin.
Transfected hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve bir mikromolar SNAP substrat çözeltisinin kuyusu başına bir mL ekleyin. Hücreleri yüzde beş CO2'de 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatır. Hücreleri fenol kırmızı serbest ortamla üç kez yıkayın ve kuyu başına iki mL fenol kırmızı serbest ortam ekleyin.
Hücreleri 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede yüzde beş CO2'de kuluçkaya yatır. Tüm numunelerin kapak fişini daha sonra görüntüleme odasına aktarın ve 500 Mikroliter görüntüleme Tamponu ile yıkayın. FRED FCS kurulumuna geçmeden önce 500 mikroliter görüntüleme tamponu ekleyin.
FRED FCS kurulumu bir konfokal mikroskopi su hedefi, iki lazer hattı, bir zaman quilter tek yabancı sayım sistemi, iki hibrid BMT ve foton toplama ve veri toplama yazılımı için iki hisse senedi ile donatılmıştır. Canlı hücrelerde ölçümden önce kurulumu her seferinde hizalamak çok önemlidir. Odak, iğne deliği ve renklendirme pozisyonunu ayarlamak için, cam kapak kaymasına iki nanomoler yeşil kalibrasyon çözeltisi yerleştirin ve kazıklar, aralanmış heyecan veya PI modunda çalıştırılan 485 nanometre ve 560 nanometre lazeri çalıştırın.
Çözeltiye odaklanın ve iğne deliği ve yaka halkası konumunu, maksimum moleküler parlaklığı elde etmek için en yüksek sayım oranı ve en küçük konfokal hacim elde olacak şekilde ayarlayın. 10 nanomoler kırmızı kalibrasyon çözeltisi ve her ikisinin bir karışımı ile kırmızı kanallar için bu işlemi tekrarlayın. Cam kapak kaymasına 10 nanomolar DNA çözeltisi yerleştirin ve iğne deliğinin odağını ve yaka halkası konumunu yeşil ve kırmızı algılama kanalları arasındaki çapraz renklerin en yüksek olduğu şekilde ayarlayın.
Bu en yüksek genliği kaynaktır. Canlı hücrelerdeki ölçümler için, işaret lambası ile sınırlayarak ve oküler gözleyerek uygun bir hücre bulun. Pi modunda her iki lazeri de aç ve saniyede maksimum sayıyı arayarak zara odaklan.
Hücre örnekleri için lazer gücünün azaltılması gerekebileceğini lütfen unutmayın. Tercihen hedefte beş mikrowatt'tan az. Bu, kullanılan floral ve kuruluma bağlıdır.
Veri toplama yazılımının çevrimiçi önizlemesinde EGP'ye bağlı beta-2 AR'nin otomatik ve çapraz harman eğrilerini gözlemleyin ve etiket problarını tutturun ve 60 ila 180 saniye arasında bir alım süresiyle birkaç sıralama ölçümü toplayın. Korelasyon seyrini ve kontrastı tüm ölçümlerden dışa aktarın. İstem ve gecikme süresi pencerelerini doğru bir şekilde tanımlamak ve veri korelasyon yazılımında mikro zaman alma seçeneğini kullanmak için lütfen burada dikkatli olun.
Toplamda üç farklı korelasyon gereklidir. Yeşil kanal istemi zaman penceresinin otomatik korelasyonu. Kırmızı kanalların otomatik korelasyonu ve gecikme süresi penceresi.
Ve son olarak yeşil kanal sinyalinin çapraz korelasyonu ve istemin zaman aralığı gecikme süresi penceresindeki kırmızı kanal sinyaliydi. İşte çözümler için yeşil ve kırmızı FRED'nin otomatik korelasyon fonksiyonları ve bunları, B'nin eğrinin temeli ve molekül ve odak sayısı olduğu iki kullanım renk kanalı için konfokal algılama hacminin şeklini ve boyutunu kalibre etmek için gereken ek bir üçlü terime sahip 3 DT difüzyon modeline sığdırmak, Difüzyon süresi ve S, omega sıfır üzerinde sıfır, konfokal hacim elemanının şekil faktörü. Üçüz yanıp sönme ve fotoğraf fiziği genlik AR ve gevşeme süresi TR olarak tanımlanır. Enfektif konfokal hacim elemanının boyutlarını ve hacmini belirlemek için yeşil ve kırmızı kalibrasyon standları için bilinen difüzyon katsayısını kullanın ve şekil faktörleri elde edin.
SPEKTRUMU IFR, kanal sıfırlarında toplanan yeşil floresan sinyali ve iki doğru algılama kanalına, kanal bir ve üçe kadar, toplanan arka plan sinyallerinin bir oranı olarak hesaplayın. Donör ekscitasyon dalga boyları tarafından kabul eden veri akışının doğrudan beklentisini, kırmızı kalibrasyon ölçümlerinin arka plan toplanan kontrastının oranına ve yeşil lazerle hızlı zaman penceresinin doğrudan kırmızı lazerle gecikme süresi penceresi ekscitasyonunda arka plan doğru hesabına oranına göre belirleyin. Toplanan kontrastı arka plana göre hem yeşil hem de kırmızı akış kuvvetinin B'nin moleküler parlaklığını hesaplayın ve molekül sayısını elde etmek ve 3 DT difüzyon uyumuna odaklanmak için.
Hem yeşil ve kırmızı kanaldan ultra korelasyonlara hem de çift seviyeli DNA'nın yeşil isteminden kırmızı gecikmesine ve 3 DT difüzyon modeline kadar korelasyon boyunca, elde edilen şekilli faktörleri otomatik korelasyon işlevleri için sabit tutar. Çapraz korelasyon işlevlerinin şekil faktörü genellikle bu iki değer arasındadır. Görünür molekül ve odak sayısının yazı tipi değerlerine göre sıfır korelasyon zamanında genliği belirleyin.
Bir numune için genlik oranının yeşil ve kırmızı zemin kuvvetinin%100 ortak difüzyonu olduğunu hesaplayın. Hücre örneklerini uygun bir modele sığdırın. Membran reseptör difüzyonlarının iki modlu bir şekilde nasıl gösterildiği kısa ve uzun bir difüzyon süresi değildi.
Ayrıca, fotoğraf fiziği ve zemin kuvvetini yanıp sönen göz kırpma göz önünde bulundurulmalıdır. TD1 ve TD2'ye, difüzyon süreleri için gerekli olan ikisi. Ve biri ilk difüzyon süresinin bir kısmı Serbest zar ve DNA iplikçiklerinin difüzyon yaptığı kalibrasyon ölçümünün aksine, tüm yönler, membran reseptörleri hücre zarları boyunca sadece 2D difüzyon gösterir, molekül sayısı ve odak açısından yeşil veya kırmızı etiket proteinlerinin konsantrasyonunu hesaplar.
Ve konfokal hacim elemanının hacmi, önyargılı kütle kullanarak. Tek düzeyli yapı ile aynı modeli ve iki modlu difüzyon modeli kullanarak çapraz korelasyon işlevini kullanarak çift etiketli örneğin iki alto korelasyonunu sığdırın, sistemin genel açıklaması için Not. Üç ürün de ortaklaşa sığmalı.
Difüzyon terimi her üç ürün için de aynıdır. Ve tek fark, itibar zamanının düşmesi, çapraz korelasyon fonksiyonudur. Yeşil veya kırmızı işgücü proteinlerinin konsantrasyonunu ilgili molekül ve odak sayısından ve konfokal hacim elemanının hacminden hesaplayın.
DNA örneklerinden elde edilen düzeltme faktörlerini, hücre örneğinin genlik oranlarını ve ilgili elde edilen konsantrasyonları kullanarak hücre örneklerinden etkileşime giren yeşil ve kırmızı etiket proteinlerinin fraksiyonunu veya konsantrasyonunu tahmin edin. FRED örneğinin iki alter korelasyonunu tek etiketli örnek olarak ve ön çapraz korelasyonu, AF'nin toplam anti korelasyon ve AR ve TR'nin genliğini ilgili genlik ve gevşeme süresini yansıttığı bir anti korelasyon terimi içeren iki modlu difüzyon modeline sığdırın. Fred'e bağlı anti-korelasyonlu floresan değişiklikleri durumunda bir veya birkaç anti korelasyon terimleri gerekebilir, bu da fred çapraz korelasyon fonksiyonunun düşük korelasyon zamanlarında bir düşüşe neden oldu ve iki otomatik korelasyon fonksiyonunda bir artışa neden oldu.
6.5 ve yeşil kanallarda ve kırmızı kanallarda 6.8 tıraş faktörlerine yeşil ve kırmızı çiçek çözeltilerinin kalibrasyon ölçümleri. Bu nedenle, konfokal hacim bu ölçüm gününün ilerleyen saatlerinde 1.4 ve 1.9 femto boyutuna sahiptir, molekül parlaklığı molekül başına 12.5 kilohertz ve molekül başına 2.6 kilohertz'dir. Donör ekscitasyonundan sonra yeşil çiçekten kırmızı kanallara çapraz konuşmanın %15'ine ve kırmızı çiçek formunun yeşil tarafından heyecanlanması dışında doğrudan %38'ine sahibiz. DNA ölçümümüzden, konfokal örtüşme hacminin düzeltme faktörlerini de 0,6 ve 0,7'ye belirleriz, tek etiket yapısı ile trans enfekte olan hücreler, moleküllerin kabaca yarısının yavaşça yayıldığı hücre zarında iki modlu iki boyutlu difüzyon gösterir 50 ila yüz milisaniyelik zaman ölçeği ve diğer yarısı her iki yapıda da nispeten hızlıdır.
Ayrıca, üçlü yanıp sönme mevcuttur. Bununla birlikte, kırmızı düzeyde yapı yapısında, 180 mikrosaniyede başka bir gevşeme süresi elde edilir, bu da İlişkisiz düz bir şekilde tutturulduğunu gösterebilir. Hücre zarının iki farklı tarafındaki iki etiketin bulunduğu anti snap yapısı ile transekte edilmiş çift etiketin kendisinden, gürültü ve kırmızı kaplama korelasyon üzerine iki daha az ölçüm toplanmıştır.
Ve PI çapraz korelasyonu burada oldukça yüksek. Burada moleküllerin % 70'i, yüz milisaniyelik zaman ölçeğinin altında yavaş ve sadece% 30'u bir milisaniye civarında hızlıysanız, çift serbest moleküllerin fraksiyonu düşüktür ve% 15 ila 25 arasındadır CT snap için veriler daha iyi görünür ve daha az gürültülüdür. Bununla birlikte, beklenen ön en derin anti korelasyon görülemez ve büyük olasılıkla yüksek miktarda çapraz konuşma, her iki çiçek kuvvetinin doğrudan kabul ekscitasyonu ve üçüz yanıp sönmesi ile kütledir ve toplanan floresan yoğunluğundan yararlanan veri analiz şemaları DKS, simüle edilmiş veri kümesi için gösterildiği gibi bunu kurtarmaya yardımcı olabilir.
Fred FCS tekniğinin avantajı, mobilite ile birlikte GPCR'lerin konferans dinamiklerini araştırabilmemizdir. Bununla birlikte, LABORATUVARLARDA FRED DC'leri gerçekleştirmek zordur ve iyi transfected hücreler, verimli etiketleme ve mükemmel kalibre edilmiş kurulum talep eder. Sadece bir FRED çift pro gücü de çok önemlidir.
Kritik deneysel adımlar arasında transfeksiyon optimizasyonunun optimizasyonu, arka planın en aza indirilmesi ve otomatik floresan sayılmaktadır. Ayrıca ve Atom analiz işlem hattı canlı hücrelerde preseptörlerin çeşitli dinamiklerini anlamaya yardımcı olacaktır. Bu protokolün canlı hücre deneylerinde FRED FCS yaklaşımını gerçekleştirmenin yararlı olacağını umuyoruz.
