Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.

NOTA: El procedimiento fue aprobado por el comité de ética de Darwin de la Universidad Pierre y Marie Curie (ce5 / 2009/048) 1. Preparación de la gelatina de soluciones, instrumentos, Vibratome, Cultura Medios de Comunicación y Cultura de la Plata <ol><li> Preparar una solución de gelatina 20% al menos un día antes del experimento. <ol><li> Bajo el capó, añadir 500 l de gentamicina [10 mg / ml] a una botella de 500 ml que contiene CO 2 medio independiente (CO 2 -i). </li><li> En un vaso de precipitados separado, añadir 20 ml de CO2-I (de la etapa 1.1.1) y se calienta a 95 ° C en un bloque de calentamiento con agitación constante durante 15 min. Observe un cambio de color a amarillo, indicando que la solución está lista para su uso posterior. </li><li> Pesar 4 g de gelatina y pobres gradualmente a la solución preparada anteriormente (etapa 1.1.2) con el aumento de la agitación y calentamiento a 95 ° C durante 45 min, para obtener una solución de color amarillo. Deje que la solución de gelatina se enfríe bajoel capó durante aproximadamente 5 minutos. </li><li> Verter 4 ml de la solución de gelatina en 35 mm placas de cultivo de diámetro sin introducir burbujas de aire. Mantenga el plato a 21 ° C durante 30 minutos. Cubra los platos con una película de plástico, y girar los platos al revés. Opcionalmente, guardar los platos a 4 ° C durante un máximo de 2 meses antes de su uso. </li></ol></li><li> Preparar una solución de gelatina 4%. <ol><li> Bajo el capó, añadir 25 ml de CO 2 medio -i en un recipiente de plástico estéril, y se calienta a 42 ° C en un bloque de calentamiento. Retire el medio del bloque de calentamiento y añadir poco a poco 1 g de gelatina para el medio caliente y revolver. Volver rápidamente el recipiente en el bloque de calentamiento (42 ° C) y mantener el calor durante el proceso. </li></ol></li><li> Instauración del aparato vibratome: <ol><li> Retire los platos que contienen solución de gelatina al 20% se almacena a 4 ° C. Cortar la gelatina con un bisturí. Da la vuelta al trozo de gelatina y pegarlo en el disco de soporte negro del vibratome usando una gota de spegamento uper. </li><li> Romper una hoja de afeitar en dos mitades, e inserte un medio en el receptáculo que sostiene vibratome. Inserte el disco de soporte negro sobre el aparato vibratome. Gire la perilla de negro en el lado derecho. Fijar el recipiente con el jefe de la vibratome. Agregue la cantidad suficiente de CO 2 medio -i en el tanque vibratome para cubrir el bloque de gelatina. </li><li> Encienda el vibratome y cortar tres 100 micras rodajas de bloque de gelatina. Mantenga el bloque de gelatina para su uso posterior. </li></ol></li><li> Preparar 40 ml de medio de cultivo: <ol><li> Preparar medio de Dulbecco modificado Eagle (DMEM) con 10% de suero de ternera fetal (FCS) bajo el capó. Preparar 1 mg / ml de poli-D-lisina usando tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4. </li><li> En una placa de 96 pocillos, añadir 2 g / cm 2 de poli-D-lisina para cubrir el fondo de los pocillos. Incubar la placa durante 45 minutos a 37 ° C en 5% de CO2. Después de la incubación, retirar PBS y reemplazar con 200 l/ Pocillo DMEM y lugar de nuevo a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora antes de usar. </li></ol></li></ol> 2. Disección de Retina completa <ol><li> Enuclear el ratón: <ol><li> Sacrificar el ratón de acuerdo a la directiva europea 2010/63: por dislocación cervical. Cortar la cabeza con curvas-tijeras y lo coloca en una placa de Petri de diámetro 100 mm después de haber desinfectado el ojo con desinfectante. </li><li> Retire el ojo después de haber separado el nervio óptico seccionando usando con mucho cuidado una empuñadura curvada. A continuación, coloque los dos ojos en una placa de Petri de 35 mm que contiene CO 2 medio -i estéril a 21 ° C. </li></ol></li><li> Extracción de la retina: <ol><li> Hacer un agujero en el nivel del ojo de la extremidad con la ayuda de una aguja de 18 G para poder introducir las tijeras en el globo ocular. Introducir tijeras rectas dentro del agujero y cortar cuidadosamente la esclerótica debajo de los iris en todo el perímetro del globo ocular para eliminar cuerpo ciliar. </li><li&gt; Eliminar la córnea y la lente y mantener la cámara posterior del ojo con la retina contigua a la esclerótica. Con dos apretones finas, quitar el vítreo situado dentro de la cámara posterior sin dañar la retina. Realizar cuatro cortes radiales (retina / esclerótica) para permitir el aplanamiento de la retina. </li><li> Repunte del globo ocular y pelarlo como &quot;naranja&quot;. Separe la retina de la esclerótica y epitelio pigmentario retiniano (EPR). Separe la retina todavía unido a nivel del nervio óptico muy cuidadosamente con finas curvas-tijeras. </li><li> Separar el vítreo restante desde la periferia hacia el centro de la retina con dos empuñaduras finas. Asegúrese de que todo el vítreo se elimina completamente para permitir el aplanamiento de la retina. </li><li> Cortar el extremo de una pipeta de plástico y transferir la retina a una placa de Petri de diámetro 35 mm que contiene CO 2 medio -i con la pipeta de plástico. </li></ol></li></ol> 3. Sellado de-mounte planad Retina en gelatina Bloquear <ol><li> Retire 20-30 ml de CO 2 medio -i del tanque vibratome (el bloque de gelatina es gratis) para permitir el sellado de retina en montaje plano. </li><li> Transferir la retina a un portaobjetos de vidrio usando una pipeta de plástico y añadir una gota de CO 2 medio -i antes de transferir a la rodaja de gelatina con el fotorreceptor hacia abajo en la rebanada de gelatina. </li><li> Coloque la retina al bloque de gelatina mediante la inyección suavemente calentado 4% de gelatina en un lado del bloque entre la retina y el bloque de gelatina y al mismo tiempo la expulsión de gelatina caliente en el otro lado. </li><li> Aspirar 4% de gelatina con una pipeta pasteur. Espere 10 minutos para permitir la total estanqueidad. Añadir CO 2 medio -i para sumergir el bloque y la pala por completo. </li></ol> 4. Seccionamiento la Retina NOTA: Este paso es crítico para obtener una capa de células fotorreceptoras sin las otras células de la retina (Figura 1). <ol><li> A partir de la parte superior del bloque de gelatina, cortar 100 m de serie de secciones para llegar a la retina. A continuación, corte 100-120 micras secciones de la capa interior. Dependiendo de la aplicación, esta capa puede ser desechada o se almacena en nitrógeno líquido. Asegúrese de que la velocidad de la vibratome es muy lento (a 1 o 2) durante el seccionamiento de la capa o capas interiores fotorreceptores. </li><li> Realizar intermedios 15 micras secciones de la retina correspondiente a la interfaz entre el interior y la retina externa. Observe esta sección con un microscopio. La ausencia de vasos sanguíneos indica que se ha alcanzado la retina externa. </li><li> Cortar 200 m de la retina externa (la capa de fotorreceptores) con gelatina y la transfiere a un plato de 35 mm de diámetro lleno con 3 ml de CO 2 medio -i. Guárdelo en hielo hasta que se obtengan todas las secciones de la capa de fotorreceptores de todas las retinas. </li></ol> 5. Las células fotorreceptoras disociar <ol><li> Sacar la fuente (es) que contiene la capa (s) de los fotorreceptores y ponerlo (ellos) en una incubadora a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Utilizando unas pinzas separan suavemente la capa de fotorreceptores de la gelatina y la transfiere en una nueva placa llena con 3 ml de solución de Ringer. Repita este paso (5.2) para cada preparación capa de fotorreceptores. </li><li> Incubar 2 unidades de papaína con 25 l de solución de activador (EDTA 1,1 mM; 5,5 mM L-cisteína; 60 mM β-mercaptoetanol) en un tubo estéril de polipropileno de 5 ml y se incuba 30 min a 37 ° C dentro de 5% de CO 2 incubadora . La activación de la papaína se consigue a 37 ° C. Durante la incubación, corte la capa de fotorreceptores en 2 mm 2 piezas (no demasiado pequeñas) y la transferencia de estas piezas en un tubos de 5 ml. </li><li> Enjuague la retina dos veces con 1,5 ml de solución de solución de Ringer, seguido por sedimentación por gravedad. Retire toda la solución restante de Ringer del tubo con la muestra. </li><li> Añadir 475 l de solución de Ringer al tubo que contiene papaína activado y mezcla. Añadir esta solución al tubo que contiene la retina. </li><li> Incubar el tubo con la retina durante 20 min a 37 ° C dentro de 5% de CO 2 incubadora. Detener la reacción mediante la adición de 1 ml de 10% de FCS en DMEM. Añadir 25 U de desoxirribonucleasa I (ADNasa I) a ADN digerido a partir de células de muerte. Homogeneizar cuidadosamente la suspensión celular usando una pipeta de 1 ml-. Gira a 50 xg durante 6 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Descartar el sobrenadante para eliminar trazas de suero y se añade medio DMEM con suplementos (ver tabla de reagents_equipment específica) a la célula-pellet y resuspender cuidadosamente la suspensión de células con una pipeta de 1 ml. Gira a 50 xg durante 6 minutos a temperatura ambiente. Repita este paso (5.7) una vez más. </li></ol> 6 cultivar células fotorreceptoras <ol><li> La capa de fotorreceptores de un ratón en PN8 contiene alrededor de 1 y 1,5 millones células utilizando esta técnica. Sembrar las células fotorreceptoras en 1x 10 5 células / cm 2 en una placa de cultivo con medio de cultivo y cultivar las células durante 5 días a 37 ° C en 5% de CO2. El día 5, proceder a la inmunoquímica y métodos de estudio tras el Western Blot proporcionados por los proveedores de anticuerpos. NOTA: Los pasos para detener la cultura y los ensayos preliminares se describen en la referencia 21. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

La retina es un modelo de órgano en la biología. Estudio de la retina llevó a 6 grandes descubrimientos en la biología. Es en el origen de la primera gen supresor de tumor RB1. Revela el vínculo molecular entre los receptores de tirosina quinasas y las MAP quinasas a través de la interacción con Hijo de sevenless. Se participó en el descubrimiento de PAX6, el primer gen de control maestro para la morfogénesis de órganos. Es en el centro de la asociación genética del factor H del complemento (CFH) con degeneración macular relacionada con la edad (AMD), el primer gen de susceptibilidad enfermedad identificada por la pantalla de asociación amplia del genoma (GWAS). Por último, se llevó a la primera terapia génica exitosa para la amaurosis congénita de Leber, el primer ensayo de terapia génica correctiva en humanos de cualquier enfermedad hereditaria. La estructura de este órgano se conserva en la mayoría de las especies de vertebrados. Su accesibilidad para la manipulación in vivo ha animado desde el principio de la genómica funcional investigaciones en esta parte integral del cientoral sistema nervioso. Mostramos aquí cómo separar la capa de fotorreceptores de la capa interna de la retina por vibratome seccionamiento. Este paso es fundamental para obtener cultivos puros fotorreceptoras. Nuestro protocolo de disección hace que la contaminación por células del RPE muy poco probable. Uno de los principales retos es el aplanamiento de la retina que es necesario seccionar adecuadamente el interior y la retina externa. El seccionamiento de la retina es mejor en la retina con diámetro pequeño como los de los roedores y este diámetro es una limitación de la técnica con el material disponible actual. Es aconsejable antes de comenzar un experimento biológicamente significativo, para practicar en una muestra de la retina. Se ilustra el método por los resultados representativos obtenidos a partir de células fotorreceptoras cultivadas, utilizando el material para estudiar la expresión de ambos ARNm y proteínas de realizar. Los estudios de expresión también se puede realizar alternativamente en seccións obtuvieron por captura láser microdissection, pero los cultivos se realizan mejor usando vibratome seccionamiento. Podríamos haber utilizado la técnica de láser microdisección con una estrategia completamente diferente. Pero, para recoger la capa de fotorreceptores con el aparato de microdisección por la cultura, sería necesario evitar fijador y esto complicaría la actual metodología de manera significativa. Estamos desarrollando un protocolo destinado a estudiar la cinética de la expresión génica y proteica en vibratome secciones durante la degeneración de fotorreceptores en modelos de retinosis pigmentaria. Creemos que la descripción detallada del protocolo será de utilidad para los investigadores en el campo de la biología de la retina, y muy especialmente para los estudios de proteómica y metabolómica.

La retina es una parte integral del sistema nervioso central que tiene una arquitectura conservada entre los vertebrados. Las neuronas de la retina neural se organizan en capas, con la más lejana de la luz incidente, la capa de fotorreceptores en estrecho contacto con el epitelio pigmentario de la retina (RPE) en la parte posterior del ojo. Conos y bastones photorecptors son células sensibles a la luz que se basan en moléculas sensibles opsina para la captura de fotones. Estas moléculas están encerradas en las membranas de disco de una estructura celular, que se encuentra en el segmento exterior del fotorreceptor que apunta en la dirección de la RPE 1. Esta estructura, que se ve afectado con mayor frecuencia muy temprano en casos de degeneración de los fotorreceptores, se renueva a un ritmo de 10% todos los días. La capa interna llamada contiene la mayoría de las otras neuronas que calculan la señal recibida de los fotorreceptores, el bipolar, amacrinas y células horizontales, así como las células ganglionares. Estas últimas con sus axonesformar un haz que es el nervio óptico. Esta estratificación es tan conservado que los biólogos han utilizado el término desplazados células amacrinas cuando las células se encuentran fuera de la capa plexiforme interna 2. Las capas de neuronas se distribuyen dentro de una armadura de las células gliales radiales Müller. Células bipolares enlazan fotorreceptores a las células ganglionares. Están situados entre la capa plexiforme externa y la capa plexiforme interna. Las células ganglionares de formar la capa plexiforme interna en relación con las células bipolares. Las células amacrin se denominan como células de asociación ubicadas en la capa plexiforme interna entre las células bipolares y células ganglionares. La capa plexiforme externa contiene células horizontales. Esta disposición única de capas neuronales del sistema nervioso central permite el aislamiento de la capa de fotorreceptores de la capa celular interna por corte de la retina en montaje plano usando un vibratome. Originalmente, se utilizó esta técnica para aislar los fotorreceptores para transplantation en el ojo del ratón rd1, un modelo de la retinitis pigmentosa humana (RP) 3. El ratón rd1 lleva una mutación recesiva en el gen PDE6B que codifica para la subunidad beta de la fosfodiesterasa-rod específico. Las mutaciones recesivas de este gen producen en los seres humanos RP 4. Después de fotorreceptores han degenerado, el paciente pierde la visión nocturna, y fotorreceptores sorprendentemente cono, que no expresan el gen mutado, degeneran en una segunda etapa. Debido a que los conos se necesitan para la visión del color y de la agudeza visual, los pacientes se vuelven progresivamente ciega y un tratamiento efectivo para la enfermedad aún no se ha desarrollado. Al injertar capa de fotorreceptores de un ratón de tipo salvaje de la degeneración cono del ratón anfitrión se retrasa 3,5. Las barras de perdidas en el modelo degenerativa de conos y bastones no podrían ser reemplazados por un trasplante porque la conexión sináptica entre las barras y las células bipolares sólo se puede obtener en una etapa específica de rdesarrollo etinal, marcado por la aparición de la expresión Nrl 6. La capa de fotorreceptores se introduce por la cirugía en el espacio subretiniano de la retina RD1-rod menos, entre el RPE y la retina externa correspondiente a sólo el 3% de los fotorreceptores restantes, los conos. Dos semanas después de la cirugía, el 40% de los conos del animal trasplantado con una capa normal de fotorreceptores sobrevivió en comparación con el animal trasplantado con una capa normal de las células de la retina interna, o al animal con operación simulada. La topografía de la supervivencia de cono, desplegada sobre toda la superficie de la retina mutado situado en la posición del tejido injertado indica que el efecto protector se debe a una molécula difusible 7. A continuación, se utilizó un sistema de co-cultivo, así como medios de cultivo condicionados para validar el hecho de que el efecto protector se basa en la secreción de una proteína por varillas 8,9. Nuestra hipótesis es que esta proteína se exprcomputan de forma continua y específicamente por varillas y que su muerte durante la primera fase de la enfermedad se disparará la degeneración secundaria de cono por la pérdida de una señal de protección de las barras de una manera autónoma no celular 10. Debido a la importancia de cono mediada por la visión central en primates esta proteína putativa será una herramienta terapéutica de gran relevancia para RP. Preservar los conos en la RP podría teóricamente evitar que un total de 1,5 millones de pacientes en todo el mundo para convertirse en ciegos 11. Hemos utilizado un enfoque de detección de alto contenido y un modelo de cultivo de cono enriquecido para identificar un ADNc que codifica Cono derivados-Rod Factor Viabilidad (RdCVF) a partir de una biblioteca de ADNc de retina 12. RdCVF es el producto empalmada del gen NXNL1 que, curiosamente es homóloga a la codificación de genes para las proteínas de tiorredoxina que participan en la homeostasis redox 13. El segundo producto de corte y empalme del gen, RdCVFL es una enzima que protege su objetivo, la proteína TAU contra oxidativo damage 14. Administración de RdCVF evita la degeneración secundaria de los conos y la pérdida de su función visual en una recesiva, y el modelo dominante de RP 12,15. Esto demuestra dos aspectos importantes de esta estrategia terapéutica innovadora 16. En primer lugar, se puede aplicar en la mayoría de los casos RP de una manera gen independiente. En segundo lugar, contrariamente al factor de supervivencia compitiendo CNTF, RdCVF está asociado con el mantenimiento de la función visual 17. La ausencia de efecto funcional puede explicar la razón de la ausencia de beneficio clínico de la administración de CNTF a pacientes con RP 18. RdCVF es muy probable que una de las señales de supervivencia importante entre los conos y bastones de rescate desde cono in vitro es inhibida por RdCVF immunodepletion 12. Además, la interrupción del gen viabilidad cono varilla derivados conduce a la disfunción de los fotorreceptores y la susceptibilidad al estrés oxidativo 19. El uso decapa de fotorreceptores está en el origen de la identificación de RdCVF y de una señal redox novela implicados en enfermedades neurodegenerativas 20. Este manuscrito describe el protocolo usado para aislar y cultivar células de la capa de fotorreceptores para caracterizar la actividad de RdCVF. Los fotorreceptores se pueden mantener en cultivo durante 5 a 7 días 21. Esta técnica también se puede utilizar para estudiar la expresión de genes específicos fotorreceptoras.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="984">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;"><a name="RANGE!A1:D28">Name of Material / Equipment</a></td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:131px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:368px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5&#8242;-diphosphocholin*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0256</td>
			<td>4.7 &#181;M Cytidine 5&#8242;-diphosphocholin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5&#8242;-diphosphoethanolamine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0456</td>
			<td>2.7 &#181;M Cytidine 5&#8242;-diphosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Linole&#239;c acid/ bovine serum albumin (BSA)*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8384</td>
			<td>100 &#181;g/ml linole&#239;c acid/ bovine serum albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-L-thyronine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td>0.03 &#181;M Triiodo-L-thyronine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-wells plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">CO2 independent (CO2-i)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18045054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps n&#176;5 Dumont</td>
			<td>Bionic</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin from porcin skin type A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GeneChip&#160;</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>U74v2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15710049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortison*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>0.55 &#181;M hydrocortison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin* (I)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884 (ITS)</td>
			<td>0.86 &#181;M insulin (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain</td>
			<td>Worthington-biochem</td>
			<td>WOLS03124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Progesterone*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7556&#160;</td>
			<td>2.0 &#181;M progesterone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5172</td>
			<td>0.28 &#181;M prostaglandin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Putrescine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td>&#160;182 &#181;M putrescine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel Albion</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissor&#160;</td>
			<td>Moria</td>
			<td>15396-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>1 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sodium Selenite* (S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884 (ITS)</td>
			<td>0.29 &#181;M Na2SeO3&#160;&#160; (S)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taurine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td>3 mM taurine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transferrin* (T)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884 (ITS)</td>
			<td>0.07 &#181;M transferrin (T)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome apparatus</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">* Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vibratome sectioning mouse retina to prepare photoreceptor cultures

La retina es una parte del sistema nervioso central que ha organizado la arquitectura, con las neuronas en las capas de los fotorreceptores, ambos conos y bastones en contacto con el epitelio pigmentado de la retina en la parte más distante sobre la retina teniendo en cuenta la dirección de la luz, y el las células ganglionares en la distancia más proximal. Esta arquitectura permite el aislamiento de la capa de fotorreceptores por vibratome seccionamiento. La retina neural diseccionado de un ratón envejecido 8 días es plana embebido en 4% de gelatina en la parte superior de una rebanada de 20% de gelatina capa de fotorreceptores mirando hacia abajo. El uso de un vibratome y una cuchilla de afeitar de doble filo, el 100 m de espesor retina interna se secciona. Esta sección contiene las células ganglionares y la capa interior con en particular las células bipolares. Una sección intermediario de 15 micras se descarta antes de recuperar 200 m de la retina externa que contiene los fotorreceptores. La gelatina se elimina por calentamiento a 37 ° C. Los pedazos de la capa externa son íncubosted en 500 l de solución de Ringer con 2 unidades de papaína activada durante 20 minutos a 37 ° C. La reacción se detuvo mediante la adición de 500 l 10% de suero de ternera fetal (FCS) en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), entonces 25 unidades de DNasa I se añade antes de la centrifugación a TA, se lava varias veces para eliminar el suero y las células se resuspenden en 500 l de DMEM y se sembraron a 1 x 10 5 células / cm 2. Las células se cultivan a 5 días in vitro y su viabilidad se calificó utilizando el ensayo en vivo / muerto. La pureza del cultivo se determina por primera vez por la observación microscópica durante el experimento. La pureza es luego validada por distribución y fijación de las células en un portaobjetos histológico y análisis utilizando un anticuerpo policlonal de conejo anti-SAG, un marcador de fotorreceptores y monoclonal de ratón anti-RHO, un marcador específico de los fotorreceptores de varilla. Alternativamente, la capa de fotorreceptores (97% barras) se puede utilizar para el análisis de gen o expresión de la proteína y para el trasplante.

Aparte de trasplante, las capas fotorreceptoras también se han utilizado para estudiar la señalización celular mediante la siembra de las células para hacer culturas fotorreceptoras 12,22. Además, se utilizan para estudiar la expresión génica y 23,24 ritmo circadiano. Hemos utilizado la capa de fotorreceptores de células de un ratón de tipo salvaje en el día postnatal 8 para preparar cultivos de fotorreceptores en ausencia de FCS y mantenido las células durante 5 días a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO 2 (Figura 1E ). Las células se fijaron a continuación, utilizando 4% paraformaldehído y luego procedieron para el análisis inmunocitoquímico utilizando métodos proporcionados por los proveedores de anticuerpos, ya sea con anticuerpo monoclonal de ratón anti-RHO (1: 250, Millipore Mab5316) o policlonal de conejo anti-SAG (1: 200, una generosa don de Igal Gery y David Hicks). Utilizamos anti-RHO y anti-SAG (aunque los conos de la etiqueta anti-SAG, varillas), debido al hecho de que el anti-SAG es un marcador temprano, que anti-RHO. La proporción de cells positivos para el anticuerpo anti-Rho está más bajos que los positivo para los anticuerpos anti-SAG (Figura 2). Esto puede explicarse por el hecho de que SAG, la arrestina varilla también se expresa por los conos que hacen que 3% de los fotorreceptores en la capa aislado, o alternativamente por el hecho de que durante la maduración post-natal de la retina, la expresión de SAG que precede de RHO 25,26. La capa de fotorreceptores también se utilizó para controlar la expresión específica de genes por los fotorreceptores de la retina de tipo salvaje y el cerebro de los animales de 35 días de ARN se prepararon utilizando CsCl ultracentrifugación 27 y se hibridan a la matriz de chips de ADN de ratón. Los mensajeros de la rodopsina (RHO), S-arrestina (SAG) y el cono-transducina (Gnat2) se expresan específicamente en la retina en comparación con el cerebro (Figura 3A). La expresión es prominente en la capa de fotorreceptores (PR) que en toda la retina que abarcala capa retiniana interna que muestra que estos genes se expresan de hecho por fotorreceptores. Para Gnat2, la expresión relativa en comparación con Rho y el SAG muestra que se expresa por los conos contenidos dentro de la capa de fotorreceptores aislado. La expresión de recoverina (Rcvrn) en la capa de fotorreceptores en comparación con toda la retina se aumenta (Figura 3B). La capa de fotorreceptores también se utilizó para controlar la expresión de Rho y GNAT2 utilizando el Western Blot siguiendo métodos proporcionados por los proveedores de anticuerpos y comparar a la capa retiniana interna (Figura 4). Nótese la ausencia de RHO y GNAT2 28, los marcadores de bastones y conos, respectivamente, en toda la retina y en la retina de rd1 ratón en día postnatal 35. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig1highres.jpg" /> Fifigura 1. Vista esquemática del seccionamiento vibratome de retina del ratón. (A) Instalación de la retina en montaje plano con el fotorreceptor hacia abajo en la rebanada de gelatina. (B) Sección de la retina interna con la hoja vibratome. (C) Sección de la retina externa añade la gelatina. (D) Control de la presencia de los fotorreceptores en el borde del fragmento de retina después del aislamiento de la capa de fotorreceptores. Barra de escala utilizado para la fluorescencia verde se utiliza un microscopio de luz blanca. Los fotorreceptores se encuentran en el borde de la imagen. (E) cultivadas de células fotorreceptoras (post-cinco días). (F) Un mayor aumento de panel de E. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" width="550" /> Figura 2. Expresión diferencial de RHO y SAG en la cultura de los fotorreceptores de ratón. (A) La tinción de los núcleos (imagen azul), (B) tinción SAG (verde), (C) tinción RHO (rojo). (D) se fusionaron. Debido a la tinción de SAG se expresa antes de lo tinción RHO, sólo dos células se doble etiquetados SAG y RHO (ver *). Barra de escala:. 23 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig3highres.jpg" /> Figura 3. Comparación de la expresión de tres genes en el cerebro y toda la retina y los fotorreceptores de los animales de tipo salvaje a los treinta y cinco días. (A) La rodopsina (RHO), S-arrestina (SAG) y el cono-transducina (Gnat2). (B) Calbindin (Calb1) y Recoverin (Rcvrn). Los datos se muestran como expresión relativa. La expresión relativa es una expresión de valorobtenida a partir de los datos de microarrays después normaliszation con el software robusta gama Multi-Media (RMA) disponibles en la base de conocimientos KBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" width="400" /> Figura 4. Expresión de RHO y GNAT2 en retina externa de una de tipo salvaje retina en postnatal día 35. La ausencia de su expresión en la retina interna y en la retina del ratón rd1 en postnatal día 35. ACTB, beta actina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <!-- Repeat of the materials table
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nombre del material / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td>Comentarios / Descripción </td></tr><tr><td> Citidina 5&#39;-diphosphocholin * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0256 </td><td> 4,7 mM citidina 5&#39;-diphosphocholin </td></tr><tr><td> Citidina 5&#39;-diphosphoethanolamine * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0456 </td><td> 2,7 mM citidina 5&#39;-diphosphoethanolamine </td></tr><tr><td> Albúmina de suero ácido linoleico / bovina (BSA) * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L8384 </td><td> 100 mg / ml de albúmina de suero ácido linoleico / bovina (BSA) </td></tr><tr><td> Triyodo-L-tironina * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6397 </td><td> 0,03 mM triyodo-L-tironina </td></tr><tr><td> 96 pocillos placa </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655-095 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio binocular </td><td> Leica </td><td> MZ-75 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 independiente (CO 2 i) </td><td> Vida Technologies </td><td> 18045054 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Life Technologies </td><td> 41966029 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas n ° 5 Dumont </td><td> Biónico </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> La gelatina de tipo de piel porcin A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td></td></tr><tr><td> GeneChip </td><td> Affymetrix </td><td> U74v2 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de gentamicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15710049 </td><td></td></tr><tr><td> Hidrocortisona * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0888 </td><td> 0,55 mM hidrocortisona </td></tr><tr><td> La insulina * (I) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 (ITS) </td><td> 0,86 mM de insulina (I) </td></tr><tr><td> Papaína </td><td> Worthington-bioquímica </td><td> WOLS03124 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td>P-6407 </td><td></td></tr><tr><td> La progesterona * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7556 </td><td> 2,0 mM de progesterona </td></tr><tr><td> La prostaglandina * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5172 </td><td> 0,28 mM prostaglandina </td></tr><tr><td> Putrescina * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5780 </td><td> Putrescina 182 mM </td></tr><tr><td> Bisturí Albion </td><td> Ccsme </td><td> 72000 </td><td></td></tr><tr><td> Scissor </td><td> Moria </td><td> 15396-00 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sodio * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8636 </td><td> Piruvato de sodio 1 mM </td></tr><tr><td> Selenita de sodio * (S) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 (ITS) </td><td> 0,29 mM Na 2 SeO3 (S) </td></tr><tr><td> Taurina * </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8691 </td><td> 3 mM de taurina </td></tr><tr><td&gt; Transferrina * (T) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1884 (ITS) </td><td> 0,07 mM transferrina (T) </td></tr><tr><td> Aparatos Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1000-S </td><td></td></tr><tr><td> * Suplementos </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1: Material y equipamiento específico de utilizarse. -&gt;

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Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Retina neural de un ratón envejecido 8 días es en la parte superior de un bloque de gelatina 4%. Después del aislamiento de la capa de fotorreceptores (200 m) por vibratome, los fotorreceptores se siembran después de la disociación mecánica y enzimática para la cultura. La capa de fotorreceptores se puede utilizar para, análisis o trasplante bioquímicos moleculares.

Vibratome Seccionamiento retina del ratón para preparar cultivos de fotorreceptores

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

vibratome-sectioning-mouse-retina-to-prepare-photoreceptor-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.7K vistas.  UMR_S 968, Institut de la Vision.  Retina neural de un ratón envejecido 8 días es en la parte superior de un bloque de gelatina 4%. Después del aislamiento de la capa de fotorreceptores (200 m) por vibratome, los fotorreceptores se siembran después de la disociación mecánica y enzimática para la cultura. La capa de fotorreceptores se puede utilizar para, análisis o trasplante bioquímicos moleculares. 

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Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of this cellular mosaic often requires that the organ of Corti is cross-sectioned. In particular, the nonsensory pillar and Deiters' cells, whose nuclei are located basally with respect to the hair cells, cannot be visualized without cross-sectioning the organ of Corti. However, the delicate cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, including the fine cytoplasmic processes of the pillar and Deiters' cells, is difficult to preserve by routine histological procedures such as paraffin and cryo-sectioning, which are compatible with standard immunohistochemical staining techniques.
Here I describe a simple and robust procedure consisting of vibratome sectioning of the cochlea, immunohistochemical staining of these vibratome sections in whole mount, followed by confocal microscopy. This procedure has been used widely for immunhistochemical analysis of multiple organs, including the mouse limb bud, zebrafish gut, liver, pancreas, and heart (see 3-6 for selected examples). In addition, this procedure was sucessful for both imaging and quantitificaton of pillar cell number in mutant and control organs of Corti in both embryos and adult mice 7. This method, however, is currently not widely used to examine the mammalian organ of Corti. The potential for this procedure to both provide enhanced preservation of the fine cytoarchitecture of the adult organ of Corti and allow for quantification of various cell types is described.

A simple procedure of vibratome sectioning the organ of Corti, followed by immunohistochemistry and confocal microscopy is described. This procedure allows for improved preservation of the fine cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, and consequently allows for accurate quantification of cell types.

Vibratome seccionamiento para la Preservación de Mejora de la citoarquitectura del órgano de Corti mamíferos

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Evaluación de la Vascular regeneración en el SNC Utilizando la retina del ratón

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámica de Terminales cono fotorreceptor axón de la retina del ratón

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

Cultivos Enriquecidos con Conos De La Retina De Embriones De Pollo Para Estudiar Las Interacciones Celulares De Varilla A Cono

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are laterally packed in the outermost layer of the retina, the photoreceptor layer, resulting in alignment of analogous subcellular compartments. Traditionally, tangential sectioning of the frozen flat-mounted retina has been used to study the movement and localization of proteins within different rod compartments. However, the high curvature of the rod-dominant mouse retina makes tangential sectioning challenging. Motivated by the study of protein transport between compartments, we developed two peeling methods that reliably isolate the rod outer segment (ROS) and other subcellular compartments for western blots. Our relatively quick and simple techniques deliver enriched and subcellular-specific fractions to quantitatively measure the distribution and redistribution of important photoreceptor proteins in normal rods. Moreover, these isolation techniques can also be easily adapted to isolate and quantitatively investigate the protein composition of other cellular layers within both healthy and degenerating retinae.

This protocol presents two techniques to isolate the subcellular compartments of murine rod photoreceptors for protein analysis. The first method utilizes live retinae and cellulose filter paper to separate rod outer segments, while the second employs lyophilized retinae and adhesive tape to peel away rod inner and outer segment layers.

Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo Lecturas de lesiones vasculares en la retina del ratón para promover la reproducibilidad

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...