Producción de nanopartículas lipídicas cargadas de siRNA utilizando un dispositivo microfluídico

El tamaño de las nanopartículas lipídicas afecta la biodistribución, el efecto antitumoral y el rendimiento de silenciamiento génico. Por lo tanto, el método de control de tamaño LNP es una técnica efectiva para producir nano medicamentos, incluidos los sistemas de administración de ARN. Este dispositivo microfluídico original, llamado dispositivo iLiNP, fue capaz de controlar el tamaño de LNP que oscila entre 20 y 100 nanómetros a intervalos de 10 nanómetros.

El dispositivo iLiNP puede producir no solo LNPs cargados con siRNA, sino también LNPS cargados con ARNm y LNPs cargados con ribonucleoproteína. Para comenzar, tome las soluciones de etanol lipídico y produzca los LNPs cargados de siRNA mezclando soluciones DOTAP, DSPC, colesterol y DMG-PEG2k en una proporción molar de 50 a 10 a 38.5 a 1.5. Ajuste la concentración total de lípidos a ocho milimolares.

Luego tome las soluciones acuosas de solución salina milimolar 154 y tampón de acetato milimolar 25 a pH 4 y filtre a través de filtros de membrana de 0,2 micrómetros o filtros de jeringa. Prepare la solución tampón de siRNA disolviendo 70 microgramos de siGL4 en un mililitro de tampón de acetato milimolar de 25 milimolares. Llene las jeringas de vidrio de un mililitro con soluciones lipídicas y acuosas, respectivamente.

Conecte las jeringas de vidrio al pico capilar utilizando conectores de jeringa, luego ajuste el caudal de las soluciones lipídicas y acuosas e introduzca las soluciones lipídicas y acuosas por separado en el dispositivo iLiNP utilizando bombas de jeringa. Recoja las suspensiones LNP en un microtubo de la salida del dispositivo iLiNP. Dializar la suspensión de LNP utilizando una membrana de diálisis de 12 a 14 kiloDalton de picos de peso molecular a cuatro grados es Celsius durante la noche contra solución salina o DPBS para LNPs POPC y LNPs cargados de siRNA, respectivamente.

Recoja las suspensiones LNP dializadas en microtubos y luego pipetee de 20 a 30 microlitros de la suspensión LNP a una celda de micro cuarzo. Finalmente, mida el tamaño de LNP, la distribución de tamaño de LNP y el índice de poli dispersidad por dispersión dinámica de luz. La distribución del tamaño de POPC LNP producida en diferentes condiciones de flujo, como el caudal total y las relaciones de caudal se muestran aquí.

Los tamaños precisos de LNP que van de 20 a 100 nanómetros se pueden controlar utilizando este dispositivo iLiNP. Los LNP de tamaño pequeño se forman en condiciones de alto caudal total. Además, los tamaños de LNP que se forman en el FRR 5 son más pequeños que los del FRR 3, independientemente del caudal total.

La distribución del tamaño de los LNPs cargados con siRNA se muestra aquí. Los siRNAs se encapsulan en los LNPs por interacción electrostática entre el lípido catiónico DOTAP y los siRNAs cargados negativamente. El dispositivo iLiNP produjo LNP catiónicos cargados con siRNA de 90 nanómetros con una distribución estrecha.

La eficiencia de encapsulación de siRNA fue del 95% debido a la interacción electrostática entre el lípido catiónico y los siRNAs cargados negativamente. Se evaluó la citotoxicidad y la actividad de silenciamiento génico de los LNPs cargados de siRNA de 19 nanómetros. Los LNPs cargados de siRNA mostraron citotoxicidad a una dosis de 10 a 100 siRNA nanomolares.

El nivel de expresión de luciferasa disminuyó dependiendo de la concentración de siRNA. Los LNP cargados de siRNA suprimieron la expresión de luciferasa al 80% a una dosis de 100 siRNA nanomolar. Las optimizaciones de las condiciones de flujo son los pasos más importantes en el protocolo para obtener los LNPs de tamaño deseado.

El método de producción de LNP basado en microfluídica, incluido el dispositivo iLiNP, no requiere ningún procedimiento complicado y se espera que se emplee como el método de producción de LNP estándar.