Este protocolo describe la síntesis de un sistema de nanopartículas que es capaz de silenciar los genes in vivo mediante la entrega de siRNAs con alta eficiencia. Simplemente intercambiando el péptido de orientación y la carga útil del aresmo, las nanopartículas fusogénicas pueden utilizarse como una formulación terapéutica potencial para enfermedades que requieren modulación génica in vivo. Hemos publicado previamente resultados utilizando la nanoplataforma fusógena contra las infecciones bacterianas grampositivas al silenciar un gen que codifica para que la inflamación en los macrófagos termine la inflamación crónica.
Antes de realizar este procedimiento, ensamble una célula de grabado de teflón que contenga una oblea de silicio en una solución de ácido fluorhídrico de tres a uno. Ejecute una corriente alterna de una forma de onda cuadrada con una densidad de corriente baja de 50 miliamperios por centímetro cuadrado durante 0,6 segundos y una alta densidad de corriente de 400 miliamperios por centímetro cuadrado durante 0,36 segundos repetidos durante 500 ciclos. Una vez terminado el grabado, retire la célula del circuito y enjuague cuidadosamente la solución de ácido fluorhídrico con una jeringa.
Luego, enjuague tres veces con etanol. Para levantar la capa porosa de la oblea de silicio, primero llene el pozo de la célula de grabado con 10 mililitros de una solución de ácido fluorhídrico de uno a 29. A continuación, ejecute una constante de 3,7 miliamperios por centímetro cuadrado durante 250 segundos.
Una vez terminado el grabado, retire la celda del circuito. La capa de silicio poroso puede tener ondas visibles, lo que indica el desprendimiento de la oblea de silicio cristalino. Lave suavemente la solución de ácido fluorhídrico y enjuague tres veces cada una con etanol y agua.
Usando una punta de pipeta, agrieta firmemente la circunferencia de la capa de silicio poroso para un desprendimiento completo. Usando etanol, recoja los fragmentos de silicio poroso, o virutas, de la célula de grabado de teflón en un bote de pesaje. A continuación, transfiera las virutas a un vial de vidrio para su almacenamiento.
A continuación, reemplace el etanol en el vial de vidrio que contiene los chips de silicio poroso con dos mililitros de agua libre de RNase. Tapar firmemente y sellar el vial con Parafilm. Coloque el vial de vidrio en un baño sonicador y suspendido de tal manera que el volumen de virutas de silicio poroso esté completamente sumergido debajo de la superficie del baño de agua.
Para evitar una pérdida significativa de agua durante la sonicación, coloque un matraz volumétrico lleno de agua, invertido de modo que la abertura del matraz toque la superficie del baño de agua. A continuación, sonicar los chips de silicio poroso durante 12 horas a 35 kilohercios con una potencia de RF de 48 vatios. Después de la sonicación, coloque el vial de vidrio sobre una superficie plana durante una hora para permitir que las partículas más grandes se asienten en la parte inferior.
A continuación, recoja el sobrenadante con una pipeta. En un vial de vidrio, agregue 72,55 microlitros de solución DMPC, 15,16 microlitros de solución DSPE-PEG y 19,63 microlitros de solución DOTAP, y mezcle por pipeteo. Coloque el vial en una campana de humo con una tapa suelta para permitir que el disolvente se evapore durante la noche.
La película seca será una sustancia turbia, dura y similar a un gel en la parte inferior del vial. A continuación, coloque un tubo de microcentrífuga que contenga 150 microlitros de nanopartículas de silicio poroso en un baño de sonicación helada previamente preparado. Bajo una ultrasonicación de 15 minutos, pipetea suavemente 150 microlitros de siRNA y 700 microlitros de cloruro de calcio de dos molares en las nanopartículas de silicio poroso.
Retire del sonicador el tubo que contiene un mililitro de nanopartículas de silicio porosa recubiertas de calcio cargadas con siRNA. Llene un vaso de precipitados ancho con agua desionizada. Remoje una membrana de policarbonato y cuatro soportes de filtro flotando sobre la superficie del agua.
A continuación, ensamble un kit de extrusión de liposoma siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, hidratar la película de lípidos secos en el vial de vidrio con un mililitro de nanopartículas de silicio porosa recubiertas de calcio cargadas con siRNA. Pipetear hasta que todos los lípidos se hayan levantado de la parte inferior del vial y se observe una solución turbia y homogénea.
Agregue una barra de agitación magnética al vial de vidrio y coloque el vial en una placa caliente para calentar las partículas a 40 grados Celsius mientras agita magnéticamente la solución durante 20 minutos. Después de esto, coloque una jeringa vacía a un lado del extrusor. A continuación, llene otra jeringa con un mililitro de la solución de nanopartícula de silicio poroso recubierto de lípidos y conecte la jeringa al otro lado del extrusor.
Comience la extrusión empujando el pistón lentamente para empujar las partículas de una jeringa, a través de la membrana de policarbonato y hacia la otra jeringa. Repita 20 veces. A continuación, recoja las partículas extruidas en un tubo de microcentrífuga.
Preparar un caldo de péptido con una concentración de péptido de un miligramo por mililitro en agua libre de RNase. En el tubo de microcentrífuga que contiene las nanopartículas de silicio porosas fusógenas recubiertas de lípidos, agregue 100 microlitros del material de péptidos y pipetee suavemente. Mantenga el tubo estático a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Para eliminar el exceso de péptido o siRNA y otros excipientes, lave en un filtro centrífugo de 30 kilodalton girando a 5.000 veces g a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugar dos veces más con un mililitro de PBS bajo la misma configuración. Después de la centrifugación, resuspender las nanopartículas de silicio poroso fusogénico conjugado con péptido final en PBS a la concentración deseada.
Las partículas pueden ser alícuotas y almacenadas a menos 80 grados Celsius durante al menos 30 días. Una síntesis exitosa de nanopartículas de silicio poroso fusogénico debe producir una solución homogénea, ligeramente opaca que puede almacenarse durante 30 días y descongelarse sin causar cambios estructurales. La falta de optimización de la relación y la concentración, así como los ciclos repetidos de congelación-descongelación pueden dar lugar a la agregación al cargar.
A medida que se extruyen las partículas, el diámetro hidrodinámico medio de las nanopartículas de silicio porosogénico medidas por dispersión dinámica de luz debe ser de aproximadamente 200 nanómetros y el potencial de zeta medio aproximadamente positivo siete milivoltios. Después de la modificación de la superficie con péptidos de orientación, el diámetro global debe ser inferior a 230 nanómetros, y el potencial de zeta promedio disminuye a menos 3,4 milivoltios. La fusión puede confirmarse etiquetando los lípidos fusogénicos con el fluoróforo lipofílico DiI y observando la localización in vitro mediante microscopía confocal.
La fusión exitosa se observa cuando los lípidos de la nanopartícula de silicio poroso fusogénico transfieren el DiI a la membrana plasmática y se localizan independientemente de los lisosomas. La fusión sin éxito mostrará la localización de DiI dentro del citoplasma de la célula y la co-localización con lisosomas. Este sistema fusogénico de nanopartículas se utiliza ahora para aplicaciones terapéuticas no sólo en infecciones bacterianas, sino también en la terapia adyuvante contra el cáncer y la inmunoterapia contra el cáncer.
Este protocolo se puede optimizar aún más para cargar más que los siRNAs. El sistema de nanopartículas fusogénicas ha demostrado potencial en la carga y entrega de cargas útiles aniónicas más grandes, como los mRNAs y los complejos CRISPR/Cas9.
