La masarimicina es uno de los pocos inhibidores de las autolisinas bacterianas que detiene el crecimiento de las células bacterianas. Se puede utilizar para investigar las diferencias entre la inactivación química y genética de las autolisinas, y proporciona un enfoque ortogonal de la genética para estudiar la fisiología bacteriana. La síntesis de masarimicina puede parecer desalentadora.
Siga de cerca los pasos que se muestran. En caso de duda si un paso de reacción funcionó, confirme mediante cromatografía de capa delgada y los cambios en los valores de RF. Para comenzar, prepare una solución 0.1-molar de ciclohexilamina, ciclohexil carboxaldehído, ácido ortoyodobenzoico y ciclohexil isocianuro en metanol.
Agregue la barra de agitación magnética, luego, mezcle cinco mililitros de ciclohexilamina y cinco mililitros de ciclohexil carboxaldehído en un matraz de fondo redondo tapado y coloque el matraz en un baño de arena en un agitador de placa caliente durante 30 minutos a 40 grados centígrados. Controle la temperatura con un termómetro colocado aproximadamente un centímetro por debajo de la superficie de arena. Después de 30 minutos, agregue cinco mililitros de ciclohexil isocianuro a la solución y revuelva durante 20 minutos adicionales a 50 grados centígrados.
Luego, agregue cinco mililitros de ácido ortoyodobenzoico a la mezcla de reacción y continúe revolviendo a 55 grados Celsius durante tres a cinco horas. Después de tres horas de agitación, monitoree el progreso de la reacción periódicamente mediante cromatografía de capa delgada, o TLC, a intervalos de aproximadamente una hora. Considere la reacción completa cuando solo un punto con un factor de retención igual a 0.3 es visible en la placa TLC.
Retire el disolvente en el evaporador rotatorio a presión reducida. Una vez que todo el metanol se evapore, disuelva el producto crudo seco en 30 mililitros de acetato de etilo y transfiéralo a un embudo separador. Extraiga acetato de etilo secuencialmente con ácido clorhídrico monomolar, agua, solución saturada de bicarbonato de sodio, agua nuevamente y solución de cloruro de sodio saturado, descartando las capas acuosas en cada extracción.
Luego, retire la capa de acetato de etilo del embudo separador y recójala en un matraz Erlenmeyer. Agregue una espátula llena de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua residual del acetato de etilo. Filtre la solución seca de acetato de etilo a través de un papel de filtro número uno para eliminar el sulfato de sodio.
Luego, lave el papel de filtro con una pequeña cantidad de acetato de etilo. La solución filtrada de acetato de etilo se evaporó a sequedad en un evaporador rotatorio a presión reducida para obtener masaromicina como aceite una vez que se retira todo el acetato de etilo. Disuelva el aceite de masarimicina en uno o dos mililitros de una solución de hexano a isopropanol 9: 1 y revuelva en una placa de agitación magnética hasta que todo el compuesto se disuelva.
Para purificar la masarimicina disuelta, realice una cromatografía flash con una columna flash de sílice de fase normal de 12 gramos. Equilibre la columna flash con 10 volúmenes de columna de fase móvil con los instrumentos ajustados a un caudal de 15 mililitros por minuto. Una vez completado el equilibrio, extraiga la masarimicina disuelta con una jeringa de cinco mililitros.
Conecte la jeringa directamente a la parte superior de la columna de flash equilibrado e inyecte la solución en la columna. Vuelva a conectar la columna cargada al sistema de cromatografía flash e inicie la elución del gradiente. Elute masarimycin desde la columna usando elución de gradiente hasta una concentración final de fase móvil de 10:90 hexano a isopropanol en 12 volúmenes de columna.
Controlar la elución de masarimicina a través de la absorción a 230 y 254 nanómetros. Para el estudio de morfología, cultive bacillus subtilis 11774 en placas de agar LB a 37 grados Centígrados. En todos los experimentos posteriores, use células de segundo paso cultivadas en cinco mililitros de caldo LB hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 1.
A continuación, utilizando una pipeta, añadir masarimicina a los tubos de cultivo marcados tratados con una concentración final de 3,8 micromoles. Para los tubos de cultivo etiquetados como control, agregue un volumen equivalente de DMSO. Coloque las muestras en una incubadora a 37 grados centígrados durante 90 minutos con agitación a 150 RPM.
Después de 90 minutos, fije químicamente los cultivos en una mezcla 1:10 de medios de cultivo y fije el amortiguador a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, use una pipeta para aplicar de 10 a 20 microlitros de las muestras fijadas químicamente a los portaobjetos de microscopio de vidrio y deje que se sequen al aire. Luego, fije con calor las muestras secas al aire calentando los portaobjetos de vidrio con un quemador Bunsen.
Después de la fijación térmica, manche las muestras con 100 microlitros de azul de metileno al 0,1%. Después de una incubación de 10 minutos con la mancha, lave el exceso de tinte con agua destilada. Luego, caliente suavemente los toboganes teñidos a 60 grados Celsius en un horno durante 15 a 20 minutos para llevar las células a un plano focal común.
Selle las muestras teñidas colocando un resbalón de la cubierta del microscopio sobre las células teñidas. Luego, selle los bordes con cemento de portaobjetos de microscopio. Coloque el portaobjetos sellado del microscopio en el escenario del microscopio y enfoque la imagen con un aumento de 100X mediante microscopía de campo brillante.
Coloque una gota de aceite de inmersión en el portaobjetos del microscopio y enfoque el campo de visión con un aumento de 1000X. Adquirir micrografías utilizando una cámara conectada al microscopio y su software asociado. Adquiera imágenes utilizando la configuración automática de balance de blancos y apertura del software.
La cromatografía flash permite una rápida purificación de masarimicina con alta pureza. Aquí se presenta la evaluación de la sinergia o antagonismo con el inhibidor de la ATPasa optoquina en S.pneumoniae. La concentración más baja del compuesto para inhibir el crecimiento bacteriano, indicada por el color azul, se considera el valor mínimo de concentración inhibitoria en presencia de un co-fármaco.
En contraste, los pozos con color rosa indican crecimiento bacteriano. Los ensayos fenotípicos que utilizaron masarimicina a 0,75 veces las concentraciones inhibitorias mínimas demostraron un fenotipo similar a la salchicha para B.subtilis y un fenotipo aglutinante para S.pneumoniae. Preste atención a la temperatura de la reacción.
Asegúrese de que la reacción se complete mediante el monitoreo con TLC. Este método se puede utilizar junto con antibióticos marcados con fluorescencia para investigar los cambios en la pared celular mediante microscopía.
