This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

1. Preparación del sobrenadante someterse a ensayo de Actividad <ol><li> Preparar una solución madre de 0,5 mg / ml de mitomicina C por disolución de la cantidad apropiada en estéril M MgSO 4 tampón 0.1 (por ejemplo, / 2 ml de tampón de 1 mg de mitomicina C). Stock de almacén a 4 ° C en un recipiente protegido de la luz (mitomicina C es sensible a la luz). </li><li> Inocular una sola colonia de P. syringae en 3 ml de medio B de King (KB) de caldo de 14. Incubar durante la noche con agitación (200 rpm) a temperatura ambiente (21-25 ° C). </li><li> A la mañana siguiente, diluir el caldo de cultivo 1/100 en 3 ml de caldo de KB fresco. Incubar durante 3-4 horas con agitación a temperatura ambiente. Añadir mitomicina C (0,5 g / ml, concentración final). Incubar el cultivo durante la noche con agitación a temperatura ambiente. NOTA: La mitomicina C causa roturas de ADN de cadena doble, estimulando así la respuesta SOS de la célula, dando lugar a la producción tanto de bacteriófago y bacteriocinas. </li><li> Pellet 1-2 ml de mitomicina C inducida cultivos por centrifugación a 20.000 xg durante 5 min en una microcentrífuga de mesa de trabajo. </li><li> Retirar y esterilizar los sobrenadantes de cultivo, ya sea haciendo pasar el sobrenadante a través de un filtro de tamaño de poro 0,22 micras o por tratamiento del sobrenadante con cloroformo (100 cloroformo l por 1 ml de sobrenadante). <ol><li> Si se utiliza cloroformo y agitar la mezcla durante 15 segundos y dejar incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, se centrifuga la mezcla a 20.000 xg durante 5 min. NOTA: cloroformo mata eficazmente células mediante la solubilización de sus membranas. El beneficio del uso de cloroformo durante la esterilización del filtro es que es más barato y más fácil de aumentar la escala de si el procesamiento de muchos (&gt; 20) muestras a la vez. Puede haber una posibilidad de que una actividad de eliminación dada se pierde después del tratamiento cloroformo como resultado de la partición en la fase orgánica. </li><li> Retire la fase acuosa superior utilizando una pipeta de 1 ml a un nuevo máximo, estériles 1,5 ó 2,0 mltubo de microcentrífuga. Tenga cuidado de no transferir cualquiera de la capa inferior de cloroformo (es mejor para eliminar menos de la fase acuosa para evitar arrastre). </li><li> Incubar el sobrenadante se transfirió destapado en una campana de ventilación para permitir que el cloroformo residual se evapore (varias horas). sobrenadantes se almacenan a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Separación y concentración de alto peso molecular compuestos bactericidas por Polietilenglicol Precipitación (PEG) <ol><li> Al sobrenadante estéril, añadir NaCl y PEG 8000 hasta 1 M y 10% concentraciones finales, respectivamente. Repetidamente invertir la muestra hasta que tanto el NaCl y PEG se haya disuelto por completo. Incubar las muestras en un baño de hielo durante 1 hora o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Centrifugar las muestras a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Un pellet debe formar en la parte inferior del tubo de centrífuga. Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento en el volumen deseado (por ejemplo, un décimo o un centésimo del sobrenadante original, volume) de tampón (10 mM Tris, 10 mM MgSO 4, pH 7,0) mediante pipeteo repetido. </li><li> Eliminar PEG residual por dos extracciones secuenciales con un volumen igual de cloroformo. <ol><li> Combinar con cloroformo precipitado resuspendido y agitar durante 10 segundos y 15 segundos, a continuación, se centrifuga la mezcla a 20.000 xg durante 5 min. Pasar la fase acuosa superior a un tubo de microcentrífuga. Repetir esta extracción hasta que no interfase blanca entre la fase acuosa y orgánica es visible (por lo general 2 extracciones en total). Permitir cloroformo residual se evapore a partir de sobrenadantes extraídos en una campana de humos. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de superposición y sobrenadantes para la Actividad <ol><li> Se inocula una sola colonia de una cepa de P. syringae a ensayar para la sensibilidad en 3 ml de KB, se incuba durante la noche con agitación a temperatura ambiente. </li><li> A la mañana siguiente, volver a diluir la cultura 1/100 en KB fresco. Incubar 3-4 horas con agitación a temperatu de la habitaciónre. </li><li> Preparar agar agua esterilizada en autoclave una suspensión 0,35-0,7% de agar en agua ultrapura (v / w). NOTA: Un balance de agar agua blanda se puede fundir en el microondas y reutilizarse varias veces, superposición fresca no tiene que estar preparado para cada experimento. Si se vuelve a utilizar agar agua, es fundamental para asegurar que se derrita por completo tras el microondas. Si no, el recubrimiento tendrá una textura granulada en solidificación que hará difícil interpretación. Si esto ocurre, fundir el agar durante varios minutos más largos en el microondas de hecho previamente. </li><li> Mantener el agar blando fundido en un baño de agua C 60 ° antes de su uso. Con una pipeta serológica estéril, la transferencia de 3 ml de agar blando a un tubo de cultivo estéril. Vuelva a colocar el tubo de cultivo de baño de agua para mantener en un estado fundido. </li><li> Para verter la superposición, deje que el agar fundido se enfríe (que debe sentirse tibia, no caliente al tacto), pero no permita que se solidifique. </li><li> En una campana estéril, inocular 100 l dela cultura cepa de ensayo en el agar suave y agitar para mezclar. Girar la cultura con la mano durante 10-15 segundos, luego se vierte en una parte inferior de agar (agar KB). Inclinar la placa en todas las direcciones para asegurar el agar blando cubre uniformemente el agar inferior. NOTA: Este medio puede ser cualquier parte inferior (1,5% de agar) medio solidificado en la que la cepa de ensayo crece vigorosamente. Para un diámetro del plato estándar de Petri de 100 mm, use ~ 20 ml fundieron medio. El agar parte inferior se puede preparar varias semanas antes de tiempo (si se mantiene a 4 ° C sin secado) o pueden ser preparados el mismo día. Si se prepara el mismo día de la realización de la superposición, lo mejor es hacerlo antes de la etapa 3.4. </li><li> Cubrir la placa y dejar que se solidifique 20-30 min. Tenga cuidado de no molestar a la placa, mientras que la solidificación. </li><li> Una vez solidificado, Colocar 2,5 l de sobrenadante (generada en las secciones 1 y 2, más arriba) sobre la superposición. Permitir a las placas para incuban durante la noche a temperatura ambiente. Observar y registrar los resultados de la mañana siguiente. NOTA:puede ser útil para realizar y detectar a partir de una dilución en serie del sobrenadante. Esto permitirá a los investigadores distinguir entre el bacteriófago y la actividad de compensación bacteriocina. En este caso, se recomienda llevar a cabo 1: 5 o diluciones 1:10. </li></ol>

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(Chapter 4), 45-92 (2007).</li><li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces.">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La técnica de superposición de agar blando se describe aquí se ha aplicado ampliamente para muchas décadas por los investigadores interesados ​​en bacteriófagos o bacteriocinas. Los principales beneficios de este enfoque son que es simple, barato y relativamente fácil de interpretar. Mediante la combinación de la superposición en agar blando con precipitación con PEG y de dilución en serie, los agentes antimicrobianos se pueden separar en altas frente a agentes de bajo peso molecular, y replicativas vs. no replicativo agentes (es decir, bacteriófago vs. tailocin, respectivamente). Finalmente, la incorporación de manipulación dirigida genética (supresión y complementación) de bacteriocina putativo o loci profago puede establecer firmemente la identidad de un compuesto antagonista dado. Recientemente, hemos utilizado este método para describir un nuevo derivado del bacteriófago bacteriocina frecuente entre las cepas de Pseudomonas syringae 9. Los medios de cultivo y condiciones indicados en el presente trabajo protocolo bien para Pseudomonas SYringae y probablemente sería suficiente para otras bacterias Gram-negativas que crecen vigorosamente bajo estas condiciones. Sin embargo, los investigadores que usan este método se desea optimizar el tiempo, medio de cultivo, el método de inducción, y la temperatura de incubación para su sistema. Los parámetros críticos incluyen la inducción de la producción de cultivo, mientras que en la fase de crecimiento logarítmica, así como la siembra de la superposición en agar blando con suficiente cultivo en fase logarítmica para asegurar una distribución uniforme de bacterias, pero no excesiva cultura, que oscurecer posibles zonas de compensación. Hay muchos bacteriocinas que no son inducidas como parte de la respuesta SOS, sino que son inducidos a través de sistemas de detección de quórum basados en péptidos (en particular, las bacteriocinas Gram-positivas 15), por lo tanto, un investigador puede querer evaluar a varios métodos de inducción diferentes (por ejemplo, modificar el contenido de nutrientes del medio inductor, o permitir que para la incubación ampliada de la cepa productora). Cuando usasesta técnica, la superposición en agar blando debe ser fundido a fondo y se mantiene a 55-60 ° C antes de la adición de la cepa de la siembra. Hemos tenido varios experimentos en los que el agar blando no se funde completamente (aunque visualmente que parecía ser) y dio lugar a una superposición con un aspecto granulado. Los resultados de una superposición de granulado pueden todavía ser generalmente interpretable, sin embargo, esto depende de la fuerza de la inhibición (inhibición más débil será más difícil de observar). A, variable de confusión final a considerar cuando se utiliza esta técnica es que se permite que la temperatura del agar fundido suficiente tiempo para enfriarse antes de la inoculación con la cepa de la siembra, con el fin de evitar la muerte de la cepa de la siembra. Para evitar este problema, nos aseguramos el agar blando es cálido, pero no caliente, para tocar. En esta línea, también hemos observado que si nos damos un tiempo inadecuado para un cultivo de siembra para aclimatarse a la agar fundido, antes de verter la superposición, que se recuperan generalmente pobre g bacterianarecimiento, que hace que la interpretación de la inhibición específica difícil o imposible de interpretar. Esto es por qué permitimos 10-15 segundos adicionales de incubación entre la vórtex y vertiendo la superposición. El equilibrio entre el mantenimiento de la agar en un estado completamente fundido (más caliente es mejor) pero no letal para la cepa de siembra (más caliente no es mejor) es uno que probablemente tendrá que ser determinado por un investigador a través de ensayo y error. Si se utiliza una etapa de precipitación con PEG, sería beneficioso incluir un control negativo donde un medio de caldo estéril se procesa de forma idéntica al sobrenadante del cultivo. Esto asegurará que la muerte de actividad no es el resultado de PEG residual o cloroformo en el sobrenadante de la muestra. Como ambos bacteriófagos y bacteriocinas tienden a ser altamente específico, no es raro encontrar ninguna actividad de eliminación aparente con una combinación dada de cepas. Esto puede resultar de una variedad de re-cepa específicasistance mecanismos, uno de ellos que la cepa de ensayo o bien carece o tiene una versión no reconocida de los receptores necesarios para la orientación de una bacteriocina o bacteriófago dado. Un método alternativo, el método de detección de bacteriocina ha sido descrito por Kawai et al. , Pero adolece de inconvenientes y no ha sido ampliamente adoptado 16. Específicamente, esta técnica requiere la observación de muestras de caldo a intervalos de tiempo que pueden ser una carga, y no permite que para la discriminación entre las actividades de matanza-bacteriófagos derivados y derivados de bacteriocina. Las principales limitaciones de esta técnica es que no es muy adecuado para los organismos que no crecen robustamente (y por lo tanto se verá privada de zonas de compensación fácilmente discernibles) o que prophages puerto o bacteriocinas que no se producen robusta en condiciones de laboratorio. La adaptación de esta técnica para detectar las bacteriocinas producidas en muestras ambientales que tanto ampliar la utilidadde esta técnica y facilitar una mayor comprensión de la función de las bacteriocinas dentro de un ambiente natural.

Recientemente, ha habido un interés significativo en la profundización de nuestra comprensión de la ecología microbiana (en particular las microbiomas de varios ambientes), así como nuevos compuestos antibacterianos para utilizar en la lucha contra los patógenos resistentes a los antibióticos 1,2. Un tema de la interconexión entre estos intereses es la comprensión de las interacciones antagónicas entre las cepas bacterianas en su ambiente natural. Existen numerosas formas en que las bacterias antagonizan competidores 3. Las bacteriocinas, un grupo diverso de compuestos proteicos, antibacterianos, durante mucho tiempo han sido estudiados por su papel en la mediación de antagonismo interbacterial, con dos de las especies más estudiadas son Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli 4,5 6, importantes patógenos humanos. Además de bacteriocinas, prophages inducidos también pueden actuar como agentes anticompetitor, lo que permite una cepa de invadir en un nicho que ya está colonizada 7. Pseudomonas syringae es un patógeno de la planta conocida para producir una gran variedad de agentes antimicrobianos, incluyendo bacteriocinas sola proteína 8, bacteriocinas de la cola de bacteriófagos derivados de 9 (denominados tailocins), así como metabolitos secundarios no proteínicos 10. Recientemente ha habido interés en la comprensión de cómo estos antimicrobianos influyen en la ecología de este organismo, así como la forma en que se pueden aprovechar para el control de enfermedades de las plantas 11. Un método ampliamente utilizado para el estudio de ambas bacteriocinas y bacteriófago es la técnica de superposición en agar blando. Este método fue descrito por primera vez por Gratia en 1936 para ayudar en la enumeración de bacteriófago 12,13. Aquí se describe la aplicación del método de superposición en agar blando, en combinación con la manipulación genética dirigida y precipitación con polietilenglicol (PEG), para distinguir entre los tres agentes antimicrobianos diferentes (un bacteriófago, un bact de alto peso moleculareriocin, y una bacteriocina de bajo peso molecular) producida por una única cepa bacteriana. El beneficio de este enfoque es que es relativamente simple y barato, por lo que, a pesar de ser decididamente &#39;baja tecnología&#39;, todavía se utiliza ampliamente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:140px;">sc-3514</td>
			<td style="width:167px;">Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34854</td>
			<td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene Glycol (PEG)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacteriological grade agar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-274</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

La técnica de superposición de agar blando se desarrolló originalmente hace más de 70 años y ha sido ampliamente utilizado en varios campos de investigación microbiológica, incluyendo el trabajo con los bacteriófagos y bacteriocinas, agentes antibacterianos proteicos. Este enfoque es relativamente barato, con requisitos mínimos de recursos. Esta técnica consiste en la detección de sobrenadante de una cepa donante (potencialmente albergar un compuesto (s) tóxico) sobre una capa de agar blando solidificada que se siembra con una cepa de prueba bacteriana (potencialmente sensible al compuesto tóxico (s)). Hemos utilizado esta técnica para seleccionar una biblioteca de cepas de Pseudomonas syringae para matar intraespecífica. Mediante la combinación de este método con una etapa de precipitación y deleciones de genes específicos, múltiples compuestos tóxicos producidos por la misma cepa se pueden diferenciar. Los dos agentes antagónicos comúnmente recuperados usando esta técnica son bacteriófagos y bacteriocinas. Estos dos agentes se pueden distinguir empleandodos pruebas adicionales simples. Realización de una dilución en serie en un sobrenadante que contenía bacteriófago se traducirá en placas individuales haciéndose menos en número con mayor dilución, mientras que la dilución en serie de un sobrenadante que contiene bacteriocina resultará una zona de compensación que se hace uniforme más turbia con mayor dilución. Además, un bacteriófago producirá una zona de compensación cuando manchado sobre una capa de agar blando fresco sembrado con la misma cepa, mientras que una bacteriocina no producirá una zona de compensación cuando se transfiere a un césped de agar blando fresco, debido a la dilución de la bacteriocina.

La combinación de la capa de agar blando y precipitación con PEG se puede utilizar para identificar y caracterizar los diferentes agentes antimicrobianos producidos por la misma cepa. La figura 1 muestra dos cepas de P. syringae (A y B) que se inhibe por tercera cepa de la misma especie. Las dos cepas, sin embargo, son inhibidas por diferentes bacteriocinas. La zona de intercambio de información sobre la cepa A presenta un borde afilado, mientras que la zona de intercambio de información sobre la cepa B es más grande, y presenta un borde no cortante. Las manipulaciones genéticas dentro de la cepa que produce que inactivan específicamente ya sea la tailocin (tailocin deficiente) o de bajo peso molecular bacteriocina de confirmación (bacteriocina deficiente) que las cepas A y B son sensibles a bacteriocinas distintos. La Figura 2 muestra que la matanza bacteriófago mediada se puede distinguir de otros antimicrobianos no replicativos mediante la comparación de una serie de dilución. Debido a que ambas bacteriocinas yprofago puede ser inducida por el tratamiento con mitomicina C, las actividades de estos dos agentes pueden se parecen mucho unos a otros (en particular si el fago activado es abundante). En el caso de la compensación bacteriófago mediada, la dilución del sobrenadante resolverá en placas individuales (zonas de compensación), mientras que de facilitación bacteriocina mediada no resolverá en tales placas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> Figura 1: distinción fenotípica de múltiples agentes antimicrobianos producidos por la misma cepa. La cepa A es sensible a una bacteriocina de alto peso molecular (tailocin), pero no un peso molecular bajo alternativa bacteriocina, como se evidencia por la falta de limpieza de la cepa deficiente en tailocin, pero no la cepa deficiente de bacteriocina. Por el contrario, la cepa B es insensible a la tailocin, pero es sensible a la bacteriocina de bajo peso molecular. El tailocin es efficiently recuperada tras la precipitación con PEG, mientras que las bacteriocinas de bajo peso molecular no lo son. WT = tipo salvaje. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> Figura 2: Distinguir entre los antimicrobianos y bacteriófagos no replicativa. (A) La dilución de un título elevado de bacteriófagos resultados en placas individuales que se convierten en menos numerosos (parte superior de alto título, bajo el título de abajo). (B) La dilución de los resultados de bacteriocinas en menos uniformemente claro que no se resuelve en placas individuales. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

El uso de la técnica de superposición Soft-agar para la detección de compuestos inhibidores en bacterias producidas

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Research

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Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

El uso de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como organismo modelo para estudiar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infección

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Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

El uso de<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Análisis del daño epitelial Producido por<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infección

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Uso de la superposición de ensayo para medir cualitativamente la producción bacteriana y sensibilidad hacia neumocócica bacteriocinas

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Concentración Determinación A través de placa Ensayos: El uso de tradicionales y novedosos sistemas de superposición

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Ensayos pronta entrada virales para la identificación y evaluación de compuestos antivirales

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasa en<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Uso de la Invertebrada Galleria mellonella como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo Mycobacterium tuberculosis

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...