Los paradigmas de aprendizaje asociativo sensorial han revelado mucho sobre la función del cerebelo y su relación con el resto del cerebro, y el comportamiento. Utilizando el ratón como organismo modelo, presentamos un método con suficiente detalle para que los laboratorios de todo el mundo implementen estos poderosos métodos de manera efectiva y económica. Nuestro protocolo permitirá a los investigadores establecer múltiples comportamientos dependientes del cerebelo.
Las funciones básicas de nuestra plataforma de investigación se pueden modificar fácilmente para adaptarse a una pregunta de investigación en particular. Para comenzar, conecte el cable de interfaz serie de la cámara a la cámara y el puerto de la cámara en el SBC. A continuación, descargue el sistema operativo para el SBC en el equipo host y cree un archivo llamado ssh en la tarjeta microSD.
Expulse la tarjeta microSD de la máquina host. Insértelo en la ranura para tarjetas microSD SBC y alimente el SBC. A continuación, para preparar el SBC para aceptar una conexión por cable al host, abra un terminal, escriba el comando ifconfig" y registre la dirección IP Ethernet del SBC.
Luego vaya a la pestaña Interfaz de la configuración de Raspberry Pi y habilite las opciones de cámara, SSH y VNC. Para establecer la conexión por cable, conecte un cable Ethernet al puerto Ethernet del SBC y a un ordenador host, y conecte el otro extremo de estos cables a un conmutador Ethernet. A continuación, mediante un cliente informático de red virtual, como VNC, acceda al escritorio mediante la dirección IP SBC y la autenticación predeterminada.
A continuación, descargue el software requerido y las bibliotecas de Python necesarias en el SBC. Para permitir el control directo sobre el microcontrolador, descargue el entorno de desarrollo integrado del microcontrolador o el software IDE. A continuación, abra una ventana de terminal SBC, navegue hasta el directorio Descargas e instale el IDE.
Después de abrir el IDE del microcontrolador, seleccione Herramientas, seguido de Administrar bibliotecas e instale la biblioteca Codificador de Paul Stoffregen. Finalmente, inserte una unidad USB en un puerto USB en el SBC e ingrese los comandos para montar el dispositivo de almacenamiento externo USB. Después de conectar el SBC al puerto de programación del microcontrolador, abra el boceto de descarga con el IDE del microcontrolador y cárguelo en el microcontrolador.
A continuación, descargue e instale la versión adecuada del IDE de Arduino en el equipo host. A continuación, descargue el DTSC_US. ino sketch en el equipo host.
Conecte el cable USB A a USB B a la computadora host y al microcontrolador. Abra el boceto y cárguelo en el microcontrolador. Conecte cables a la placa de pruebas del microcontrolador, LED, codificador rotativo, motor paso a paso con un controlador y válvula solenoide con controlador.
A continuación, conecte un canal de una fuente de alimentación a los pines positivo-V y GND del controlador del motor paso a paso. Después de encender la fuente de alimentación, ajuste el voltaje del canal conectado a 25 voltios. A continuación, conecte el cable positivo de una fuente de alimentación al pin de voltaje de retención del controlador de la válvula solenoide y el otro cable positivo al pin de voltaje de pico.
Después de encender la fuente de alimentación, ajuste el canal conectado al voltaje de pico a 12 voltios y el canal conectado al voltaje de retención a 2.5 voltios. Luego conecte una fuente de aire regulada a una presión de 20 libras por pulgada cuadrada a la válvula solenoide. A continuación, para hacer la rueda de carrera, corte una rueda de tres pulgadas de un rodillo de espuma y perfore un agujero de un cuarto de pulgada en el centro exacto de la rueda.
Luego inserte un eje de un cuarto de pulgada en la rueda y fíjelo en su lugar con bujes de sujeción. Coloque el codificador rotativo en un canal de aluminio de 4,5 pulgadas. Luego estabilice el canal de aluminio en la placa de pruebas de aluminio.
Después de conectar la rueda al codificador rotativo, estabilice el lado libre del eje de la rueda con un rodamiento insertado en una abrazadera final de ángulo recto, instalada en un poste óptico montado en la placa de pruebas. A continuación, coloque los reposacabezas con postes ópticos y abrazaderas de poste en ángulo recto. A continuación, coloque el LED de estímulo condicional y la salida de la válvula solenoide para el estímulo incondicional DEC alrededor de la rueda ensamblada.
A continuación, monte el motor paso a paso utilizado para el estímulo incondicional DTSC y la cámara Pi en un poste óptico. Coloque la matriz de luz infrarroja en el mismo lado que la cámara Pi, ligeramente por encima y directamente mirando hacia donde se colocará la cara del animal. Haga un estímulo táctil para el acondicionamiento de sobresalto táctil retrasado pegando espuma con cinta adhesiva al borde de una pieza de acrílico.
Monte en un eje de un cuarto de pulgada con un cubo de sujeción, luego conecte el estímulo táctil al eje del motor paso a paso. Para implantar una placa de la cabeza, anestesia al ratón, luego haz una incisión con un bisturí a lo largo de la línea media del cuero cabelludo, desde el borde posterior de los ojos hasta el cráneo. Abra la incisión y sujete ambos lados con hemostáticos para mantenerla abierta.
Usando pegamento de cianoacrilato, fije la placa de la cabeza al cráneo. Luego aplique una mezcla de polvo de cemento dental, solvente y catalizador en todas las áreas del hueso expuesto. Sutura la piel cerrada, detrás y delante de la placa de la cabeza.
Luego inyecte analgesia postoperatoria, mientras permite que el ratón se recupere durante al menos cinco días. Para preparar a los ratones para las sesiones de comportamiento, permítales habituarse a la plataforma montándolos en el reposacabezas. Antes de la sesión, asegúrese de que la salida de la válvula solenoide esté centrada en el ojo objetivo, colocada a menos de un centímetro de distancia, y que el estímulo táctil esté centrado en la nariz del ratón, colocada aproximadamente a 1,5 centímetros de distancia.
Para la preparación de la sesión DTSC, inicie la GUI desde un terminal SBC. Ejecute una sesión de prueba de tres pruebas y asegúrese de que los datos registrados que se imprimen en el terminal muestran una desviación de más de 20, pero menos de 100 pasos. Para ejecutar una sesión, monte un mouse en el reposacabezas e inicie la GUI desde el terminal SBC.
Para guardar las grabaciones de la cámara, presione el botón Transmitir antes de comenzar la sesión. Ingrese la información de identificación del animal en el campo Identificación de animal y presione el botón Establecer. Luego ingrese los parámetros de experimento deseados y presione el botón Cargar en Arduino.
Finalmente, presione Iniciar sesión para comenzar la sesión. Los resultados del entrenamiento DEC de una sesión de grabación con iluminación aceptable se muestran aquí. Las condiciones de iluminación aceptables dieron como resultado un buen contraste entre el ojo y el pelaje periocular.
El rendimiento de un solo ratón entrenado durante ocho sesiones mostró rastros de comportamiento, sin respuesta condicionada en el ratón no entrenado, y respuestas condicionadas robustas una vez que el ratón es entrenado. Un video de prueba de muestra muestra a un ratón entrenado cerrando con éxito su ojo en respuesta al estímulo condicional LED, mientras que el ratón no entrenado no parpadea hasta el estímulo incondicional. La respuesta condicionada aumenta en tamaño y frecuencia a través de sesiones de comportamiento realizadas a lo largo de los días.
Las condiciones de iluminación subóptimas limitan severamente la calidad de los datos adquiridos. Cuando el contraste entre el ojo y el pelaje circundante es bajo, los cambios leves en la imagen pueden alterar significativamente la forma grabada de la respuesta incondicionada durante una sola sesión y disminuir la relación señal-ruido para detectar la posición del párpado. Los resultados del entrenamiento DTSC para un ratón entrenado durante cinco sesiones se presentan aquí.
Un video de prueba de muestra muestra a un ratón entrenado apoyando con éxito la rueda en respuesta al estímulo condicional LED, mientras que un ratón no entrenado no puede mover la rueda hasta que se aplica el estímulo incondicional táctil. La frecuencia y la amplitud de la respuesta condicionada aumentan a medida que avanza el entrenamiento. En una cohorte de animales entrenados con un estímulo incondicional que produjo respuestas incondicionadas de baja amplitud, ningún animal aprendió a producir consistentemente respuestas condicionadas después de cuatro días de entrenamiento.
Para un comportamiento exitoso, la comodidad del animal mientras corre en la plataforma es crítica. Es importante asegurarse de que la rueda gire libre y uniformemente antes de habituar a los animales a la plataforma. Usando esta plataforma flexible, hemos fotografiado y perturbado con éxito la actividad de las neuronas de Purkinje, las células de salida del cerebelo, durante el aprendizaje en animales con la cabeza fija.
