Este protocolo permite cuantificar los niveles y la dinámica de la metilación de la arginina. Esta modificación juega importantes funciones reguladoras y podría servir como un biomarcador para la enfermedad. La ventaja de este método es que proporciona un flujo de trabajo simple para un número casi ilimitado de matrices que van desde células, medios hasta tejidos y biofluidos.
La metilación de la arginina está elevada en muchos cánceres humanos y los primeros inhibidores de las transferasas del método de arginina se prueban en ensayos clínicos. Este método podría ayudar con la estratificación de los pacientes y la evaluación del riesgo. Demostrando el procedimiento estará Hansjorg Habisch, un técnico de investigación de mi laboratorio.
Para muestras líquidas, agregue 400 microlitros de metanol helado a 200 microlitros de la muestra seguido de incubación durante 30 minutos a menos 20 grados centígrados. Centrifugar esta muestra a 10, 000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Mueva el sobrenadante y recoja el pellet en tubos de 1,5 mililitros.
Para materiales sólidos, agregue 600 microlitros de agua con metanol al 66% en tubos de pulpa que contengan de 30 a 60 miligramos de tejido o gránulos celulares. Homogeneice el tejido blando una vez durante 20 segundos y el tejido rígido dos veces durante 20 segundos con un intervalo de cinco minutos entre ellos. Coloque inmediatamente la muestra en hielo y transfiera todo el lisado a un nuevo tubo de 1,5 mililitros, seguido de incubación.
Luego, centrifugar la muestra a 10, 000 G durante 30 minutos. A cuatro grados centígrados, seleccione el sobrenadante en tubos de 1,5 mililitros y proceda con la hidrólisis de proteínas utilizando este sobrenadante. Truncar las tapas de cada tubo.
Luego agregue 500 microlitros de nueve molares de ácido clorhídrico a cada muestra. Finalmente, coloque los tubos en tubos de vidrio. Ciérrelos con tapas herméticamente, asegurando un sellado adecuado, y coloque estos tubos en un vaso de precipitados de vidrio parcialmente lleno de arena.
Hidrolizar las muestras durante 16 horas a 110 grados centígrados en una cámara de secado. Enfriar las muestras y liofilizarlas durante la noche utilizando una centrífuga de alto vacío. Al día siguiente, disuelva los gránulos completamente secos en un mililitro de ácido clorhídrico molar 0.1.
Agregue 50 microlitros de cloroformo a cada tubo y disuelva completamente el pellet con una pipeta de 1.000 microlitros. Transfiera el volumen completo a un tubo nuevo y centrifugue las muestras durante 10 minutos. Recoja cuidadosamente la fase superior del líquido bifásico en un tubo nuevo.
Utilice tubos de plástico para la extracción manual o de vidrio para la extracción robótica en fase sólida. Para la extracción manual en fase sólida, acondicione previamente los cartuchos en cada ejecución seguida de una centrifugación de un minuto. Después de eso, cargue la muestra en cartuchos SPE y centrifuércelos a 600 G durante dos minutos a temperatura ambiente.
Lave los cartuchos con un mililitro de agua tres veces, cada lavado seguido de centrifugación durante un minuto. Luego lavar cinco veces con un mililitro de ácido clorhídrico molar 0.1, seguido de centrifugación durante un minuto a 800 G a temperatura ambiente. Lave los cartuchos dos veces con un mililitro de metanol seguido de centrifugación durante un minuto.
Eluya la arginina y sus derivados en un solo tubo de 15 mililitros agregando un mililitro de solución de reemplazo de tres X y centrifugar dos veces durante un minuto. Para la extracción robótica en fase sólida, coloque tubos para la recolección de eluidos y los tubos de vidrio que contienen la fase superior del líquido bifásico en la posición respectiva del robot. Utilice una aplicación o método en el software basado en los pasos descritos para SPE manual.
Liofilizar las muestras durante la noche para que se sequen completamente para eliminar el amoníaco y el agua. Disuelva cada muestra en 500 microlitros de tampón de RMN hasta que sea homogénea. Luego transfiera una cantidad igual de muestra homogénea a cada tubo de RMN.
Aquí se muestran los espectros J-RES de hidrolizados de proteínas de levadura purificados utilizando el protocolo SPE. Diferentes cambios químicos característicos pueden discriminar L-arginina y ADMA a 3.25 y 3.02 partes por millón. Ambas sustancias pueden separarse y cuantificarse en una matriz celular.
Basado en el número de protones del grupo metilo o metileno específico en el cambio químico respectivo, una espectroscopia de resonancia magnética nuclear H permite una cuantificación precisa. Usando este enfoque, los cambios químicos de resonancia magnética nuclear de H de SDMA y MMA se pueden separar y cuantificar mediante cambios químicos característicos a 2.76 partes por millón de SDMA y 2.74 partes por millón de MMA. Al realizar este protocolo, recoja cuidadosamente la fase superior del líquido bifásico que contiene la fracción soluble en agua con una pipeta y transfiérala a nuevos tubos.
Utilice tubos de 1,5 mililitros para SPE manual o vidrio de clase para SPE robótico. Evite derramar sobre el cloroformo y su contenido. Los eluidos que contienen arginina y las especies de arginina metilada se analizan mediante espectroscopia de RMN.
Esto produce cantidades absolutas de estas especies. Nuestra tecnología se utiliza actualmente en una gran cantidad de proyectos de investigación básica destinados a diseccionar el papel fisiopatológico de la metilación de la arginina. Además, estamos evaluando la metilación de la proteína arginina como candidato a biomarcador en varias enfermedades humanas.
