La configuración de flexión en voladizo descrita en este protocolo crea un enfoque reproducible para generar fracturas de cuello femoral, que son más relevantes clínicamente y se pueden utilizar en estudios murinos para observar la osteoporosis. Este protocolo crea una plataforma de pruebas que mejora la reproducibilidad, lo que lleva a una disminución del coeficiente de variación en las medidas de resultado. Por lo tanto, minimiza el tamaño de la muestra necesario para estudios robustos.
Comience cortando secciones de tubos de longitud de 1/2 pulgada a 1 pulgada usando tubos de aluminio cuadrados de 1/4 de pulgada por 1/4 de pulgada. Etiquete cada segmento de aluminio con los ID de muestra con una herramienta de grabado. Llene la mitad de los segmentos de los tubos con masilla y colóquelos en un accesorio para mantenerlos en posición vertical.
Coloque los fémures limpios planos en la mesa de trabajo para que la superficie anterior esté hacia arriba. Luego, coloque la guía impresa en 3D directamente debajo del tercer trocánter, donde el diámetro del eje se vuelve consistente. Sostenga los extremos proximal y distal con una mano.
Presione firmemente el fémur sobre el banco de trabajo y, con la otra mano, coloque la guía impresa en 3D en el eje medio del fémur para evitar que el fémur gire hacia el lado lateral o medial. Luego, colóquelos frente a los segmentos de aluminio correspondientes. Llene los segmentos de aluminio con cemento óseo hasta que estén casi llenos, dejando un poco de espacio para el desplazamiento.
Coloque los fémures con guías en el segmento de aluminio correcto y permita que el cemento óseo se cuaje. Después de que el cemento óseo se haya endurecido, coloque las muestras en una placa de Petri con PBS a temperatura ambiente y deje que se rehidraten durante dos horas. Utilice un sistema de pruebas mecánicas para conectar y calibrar una célula de carga con una resolución inferior a 1 Newton.
Coloque un accesorio con una ranura cuadrada para sujetar firmemente los segmentos de aluminio con las muestras. Coloque los tornillos de ajuste en los dos lados del accesorio de sujeción para mantener firmemente las muestras en su lugar. Luego, conecte una placa de carga en el actuador.
Coloque un microscopio estéreo en una superficie directamente frente al MTS. Coloque fuentes de luz alrededor del sistema si se necesita iluminación adicional para ver la configuración a través del microscopio. En el software MTS, comience la creación de un nuevo protocolo de flexión.
Asegúrese de que el protocolo operará en el control de desplazamiento. Establezca la velocidad de carga del protocolo en 0,5 milímetros por segundo. Si el software tiene una configuración para las teclas programables, agregue las teclas programables Balance y Zero Extension al protocolo.
Asegúrese de que el programa de software registre el tiempo en segundos, la carga en Newtons y la extensión o desplazamiento en milímetros a una frecuencia de muestreo mínima de 100 hercios. Guarde el nuevo protocolo y vuelva a la pantalla principal del programa de software para comenzar la prueba de un nuevo conjunto de muestras. Obtenga una imagen de rayos X de las muestras en las macetas de aluminio.
Se pueden obtener imágenes de varias muestras a la vez. Asegúrese de que se capture la vista anterior de las muestras para permitir la verificación de las mediciones del ángulo de maceta. Coloque un segmento de aluminio con muestra en el accesorio de sujeción y apriete los tornillos del conjunto.
Baje el actuador hasta que esté a unos pocos milímetros de la cabeza femoral. Use el microscopio estereoscópico para ajustar la etapa biaxial para alinear la posición de la cabeza femoral directamente debajo de la placa de carga. Bloquee la etapa biaxial en su lugar.
En el software MTS, ponga a cero la posición del actuador y equilibre la célula de carga utilizando las teclas programables agregadas Balance y Zero Extension. Luego, comience el protocolo de carga. Dependiendo de cuánto espacio quedó entre la placa de carga y la muestra, las pruebas solo tomarán de 10 a 30 segundos.
Después de la prueba, capture otra radiografía anterior de la muestra. Esto se utilizará para discernir y documentar el modo de fractura. Aquí se presentan los coeficientes de variación, o COV, de las propiedades de flexión medidas de los cuellos femorales de ratón.
COV representa la relación entre la desviación estándar y la media de un conjunto de datos, y su disminución indica una agrupación más estrecha de los puntos de datos individuales alrededor de la media. Este protocolo disminuyó el COV para la carga máxima en comparación con otras publicaciones que realizan pruebas similares. Se utiliza una curva de desplazamiento de fuerza representativa que muestra un ajuste lineal de desplazamiento del 0,2% para derivar la rigidez y el punto de rendimiento.
Las medidas de resultado seleccionadas se trazan, mostrando la media y la desviación estándar, incluida la carga máxima en la falla, la rigidez, el desplazamiento máximo en la falla y el trabajo hasta la falla. Los asteriscos indican diferencias significativas determinadas mediante una prueba t no apareada de una cola. Los cuellos femorales de los ratones machos fueron significativamente más fuertes y rígidos que los especímenes de ratones hembra.
Además, los cuellos femorales femeninos experimentaron deformaciones más significativas y trabajaron hasta el fracaso en comparación con los especímenes de ratones machos. Esto es consistente con la menor densidad mineral ósea en las mujeres y subraya la sensibilidad de la prueba para detectar diferencias fisiológicamente relevantes. Las medidas de resultado biomecánicas, incluida la carga máxima, la rigidez, el desplazamiento máximo y el trabajo hasta el fracaso, se trazaron contra el ángulo de maceta y se correlacionaron mediante una regresión lineal simple para la cohorte masculina, la cohorte femenina y todas las muestras agrupadas.
Las líneas negras sólidas muestran la regresión lineal de las muestras de grupo, y las líneas punteadas indican intervalos de confianza. La variabilidad en el ángulo de maceta no afectó significativamente la carga máxima, el desplazamiento máximo o el trabajo de falla. Sin embargo, a medida que aumentaba el ángulo de maceta, aumentaba la rigidez.
Lo más importante que debe recordar al intentar este protocolo es mantener el procedimiento de maceta y las tasas de carga iguales para comparar mejor sus resultados con los datos publicados anteriormente. Si se utiliza una alternativa al cemento óseo, como una aleación de bismuto que se puede ablandar para eliminar la muestra después de la prueba, las muestras pueden someterse a otros procedimientos, como espectroscopia Raman, DEXA o flexión de tres puntos, para dilucidar propiedades mecánicas, químicas y estructurales adicionales.
