A configuração de dobra cantilever delineada neste protocolo cria uma abordagem reprodutível para a geração de fraturas no pescoço femoral, que são mais clinicamente relevantes e podem ser utilizadas em estudos de murina para olhar a osteoporose. Este protocolo cria uma plataforma de testes que melhora a reprodutibilidade, levando à diminuição do coeficiente de variação nas medidas de resultado. Portanto, minimiza o tamanho amostral necessário para estudos robustos.
Comece cortando seções de tubos de comprimento de 1/2 polegada a 1 polegada usando tubos de alumínio quadrado de 1/4 polegada. Rotule cada segmento de alumínio com os IDs de amostra com uma ferramenta de gravação. Encha metade dos segmentos de tubulação com massa e coloque-os em uma luminária para segurá-los eretos.
Coloque os fêmures limpos no banco para que a superfície anterior esteja voltada para cima. Em seguida, coloque o guia impresso em 3D logo abaixo do terceiro trochanter, onde o diâmetro do eixo se torna consistente. Segure as extremidades proximal e distal com uma mão.
Pressione firmemente o fêmur na bancada e, por outro lado, coloque o guia impresso em 3D no eixo médio do fêmur para evitar que o fêmur gire para o lado lateral ou medial. Em seguida, coloque-os em frente aos segmentos correspondentes de alumínio. Encha os segmentos de alumínio com cimento ósseo até quase cheio, deixando um pouco de espaço para deslocamento.
Coloque os fêmures com guias no segmento correto de alumínio e deixe o cimento ósseo definir. Depois que o cimento ósseo endurecer, coloque as amostras em uma placa de Petri com PBS de temperatura ambiente e deixe-as se reidratar por duas horas. Use um sistema de teste mecânico para fixar e calibrar uma célula de carga com a resolução inferior a 1 Newton.
Conecte uma luminária com um entalhe quadrado para segurar firmemente os segmentos de alumínio com as amostras. Conecte os parafusos definidos aos dois lados da luminária para segurar firmemente as amostras no lugar. Em seguida, coloque uma placa de carregamento no atuador.
Coloque um microscópio estéreo em uma superfície diretamente em frente ao MTS. Coloque fontes de luz ao redor do sistema se for necessária uma iluminação adicional para ver a configuração através do microscópio. No software MTS, inicie a criação de um novo protocolo flexural.
Certifique-se de que o protocolo funcionará no controle de deslocamento. Defina a taxa de carregamento do protocolo para 0,5 milímetros por segundo. Se o software tiver uma configuração para teclas macias, adicione as teclas macias Balance e Zero Extension ao protocolo.
Certifique-se de que o programa de software registrará o tempo em segundos, a carga em Newtons e a extensão ou deslocamento em milímetros a uma taxa mínima de amostragem de 100 hertz. Salve o novo protocolo e retorne à tela principal do programa de software para iniciar os testes de um novo conjunto de amostras. Obtenha uma imagem de raio-X das amostras nos potes de alumínio.
Várias amostras podem ser imagens ao mesmo tempo. Certifique-se de que a visão anterior das amostras seja capturada para permitir medições de verificação do ângulo de vaso. Coloque um segmento de alumínio com amostra na luminária e aperte os parafusos do conjunto.
Abaixe o atuador até que esteja dentro de alguns milímetros da cabeça femoral. Use o microscópio estéreo para ajustar o estágio biaxial para alinhar a posição da cabeça femoral diretamente sob a placa de carregamento. Bloqueie o estágio biaxial no lugar.
No software MTS, zero a posição do atuador e equilibre a célula de carga usando as teclas macias adicionadas Balance e Zero Extension. Então, comece o protocolo de carregamento. Dependendo de quanto espaço ficou entre a placa de carregamento e a amostra, o teste levará apenas de 10 a 30 segundos.
Após o teste, capture outro raio-X anterior da amostra. Isso será usado para discernir e documentar o modo de fratura. Os coeficientes de variação, ou COV, a partir de propriedades flexíveis medidas dos pescoços femorais do rato são apresentados aqui.
O COV representa a razão do desvio padrão e da média de um conjunto de dados, e sua diminuição indica um agrupamento mais apertado dos pontos de dados individuais em torno da média. Este protocolo diminuiu o COV para carga máxima em comparação com outras publicações que realizam testes semelhantes. Uma curva de deslocamento de força representativa exibindo um ajuste linear de 0,2% é usada para derivar a rigidez e o ponto de rendimento.
As medidas de desfecho selecionadas são traçadas, exibindo média e desvio padrão, incluindo carga máxima em falha, rigidez, deslocamento máximo na falha e trabalho para falha. Asteriscos indicam diferenças significativas determinadas usando um teste t não-de cauda única. Os pescoços femorais para camundongos machos eram significativamente mais fortes e mais rígidos do que espécimes de camundongos fêmeas.
Além disso, os pescoços femorais femininos experimentaram deformações mais significativas e trabalham para falhar em comparação com espécimes de camundongos machos. Isso é consistente com a menor densidade mineral óssea em fêmeas e ressalta a sensibilidade do teste para detectar diferenças fisiologicamente relevantes. As medidas de desfecho biomecânico, incluindo carga máxima, rigidez, deslocamento máximo e trabalho de falha, foram traçadas contra o ângulo de vaso e correlacionadas usando uma simples regressão linear para a coorte masculina, coorte feminina e todas as amostras agrupadas.
Linhas pretas sólidas mostram regressão linear de amostras de grupo, e linhas pontilhadas indicam intervalos de confiança. A variabilidade no ângulo de vaso não afetou significativamente o trabalho máximo de carga, deslocamento máximo ou falha. No entanto, à medida que o ângulo de vasos aumentava, a rigidez aumentava.
A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este protocolo é manter o procedimento de envasamento e as taxas de carregamento iguais para comparar melhor seus resultados com dados publicados anteriormente. Se usar uma alternativa ao cimento ósseo, como uma linha de bimóbica que pode ser suavizada para remover a amostra após o teste, as amostras podem ser submetidas a outros procedimentos, como espectroscopia de Raman, DEXA ou dobra de três pontos, para elucidar propriedades mecânicas, químicas e estruturais adicionais.
