Vamos a mostrarle cómo preparar el cultivo ex ovo de codorniz japonesa y cómo usar la membrana corioalantoica o CAM en resumen para el diagnóstico fotodinámico y la terapia del cáncer o las infecciones microbianas. Las ventajas de este método son el rápido crecimiento del desarrollo, el tamaño pequeño, el buen acceso al tejido y el fácil manejo. Además, respeta los principios de la regla 3R para realizar investigaciones con animales.
Debido a su similitud estructural con las membranas mucosas como la vejiga, los pulmones o la placenta, es adecuado para pruebas in vivo de posibles fármacos, pruebas de toxicidad o estudios de trasplante. Demostrando el procedimiento estarán Barbora Kundekova y Majlinda Meta, estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, use huevos de codorniz fertilizados, frescos o almacenados a 10 a 15 grados centígrados durante un máximo de 4 a 5 días antes del inicio de la incubación.
Use solo huevos limpios y sin daños, luego incube los huevos en una incubadora de tiro forzado a 50 a 60% de humedad y 37.5 grados centígrados durante aproximadamente 54 horas colocadas horizontalmente con las rotaciones de huevos apagadas. Desinfecte la superficie del huevo con etanol al 70% sin rotar el huevo. Luego, en un gabinete de flujo laminar estéril mientras usa guantes, abra la cáscara del huevo con tijeras quirúrgicas estériles pequeñas y transfiera el contenido a una placa de cultivo de 6 pocillos.
Después de cada huevo, desinfecte las tijeras con etanol al 70%. Agregue aproximadamente 5 mililitros de agua estéril a los huecos en la placa de 6 pocillos, ya que la humedad es esencial para evitar que la CAM se seque. A continuación, aspire embriones con la punta incorrecta u óvulos no fertilizados con un aspirador al vacío, luego coloque los embriones en una incubadora hasta nuevos experimentos mientras mantiene una temperatura de 37 grados centígrados en 80 a 90% de humedad.
Cuando la CAM esté lo suficientemente desarrollada, generalmente desde el día embrionario 7, coloque un anillo de silicona esterilizado en la superficie de la CAM a lo largo de los capilares pequeños evitando los vasos sanguíneos principales. En condiciones estériles, aplique un volumen apropiado de solución de hipericina 30 microlitros al anillo de silicona y mantenga los embriones en una incubadora a 37 grados centígrados en 80 a 90% de humedad. Para realizar un diagnóstico fotodinámico, ilumine el CAM con luz de excitación violeta y registre la fluorescencia de la hipericina y el tejido CAM y las células tumorales con una cámara digital en diferentes intervalos de tiempo después de la administración de hipericina.
Si la investigación requiere una imagen de la CAM en luz blanca, registre la CAM antes de la administración de hipericina y al final del experimento poco antes de la fijación del tejido, ya que la luz desencadena la fotoactivación de la hipericina. Para realizar la terapia fotodinámica después de la aplicación de hipericina, coloque la CAM debajo de la fibra óptica para que el rayo láser cubra toda el área dentro del anillo de silicona. Después de realizar la irradiación in vivo, en este caso particular con una luz láser de 405 nanómetros a una tasa de fluencia de 285 milivatios por centímetro cuadrado, grabar CAM utilizando luz blanca y / o luz fluorescente antes y después del tratamiento fotodinámico.
Fije el tejido CAM en una placa de cultivo con paraformaldehído al 4% en PBS durante un mínimo de 2 horas y un máximo de durante la noche, luego retire el paraformaldehído y corte cuidadosamente del CAM una parte del tejido dentro del anillo de silicona. Todos estos pasos deben hacerse en una campana extractora. Lave la parte cortada del tejido CAM en agua durante 10 minutos y luego deshidrate en series ascendentes de alcohol colocando el tejido CAM en etanol al 70% durante 3 minutos, solución de eosina durante 2 minutos, throcin 96% etanol durante 5 minutos, 100% etanol durante 5 minutos y dos veces en xileno durante 10 minutos en una nueva placa de Petri.
Posteriormente, transfiera las muestras lo más rápido posible a la parafina disuelta en placas de Petri utilizando una espátula o un cepillo fino. Después de 24 horas, coloque el tejido en un molde histológico, llénelo con un medio de incorporación de parafina y deje que se solidifique en el refrigerador, luego corte el CAM solidificado del medio de inserción, gírelo en la bandeja 90 grados, llénelo nuevamente con el medio de incrustación y deje que se solidifique. Preparar secciones de 5 a 10 micrómetros en un micrótomo para el análisis histopatológico para determinar el daño inducido por PDT.
Para preparar las secciones CAM congeladas para la histología, monte cuidadosamente CAM nativa o fija con paraformaldehído al 4% en el portaobjetos de vidrio, llene el molde de incrustación a la mitad con OCT y congélelo en nitrógeno líquido o una mezcla de hielo seco y etanol. Después de la congelación, incline y deslice con cuidado la CAM desde el portaobjetos de vidrio hasta la parte superior del medio OCT congelado. Colocar de nuevo en el molde, cubrirlo con medio OCT y congelar como se describió anteriormente.
Para el análisis de la vasculatura CAM, se necesitan muestras CAM completas. En el gabinete de flujo laminar, desbordar CAM con una solución de fijación precalentada de aldehído paraformado al 4% y glutaraldehído al 2% en PBS, luego retire la solución de fijación después de 48 horas. A continuación, separe cuidadosamente el CAM del embrión con microtijeras y un cepillo fino y lávelo en PBS, luego monte el CAM lavado en un portaobjetos de vidrio y déjelo secar lentamente.
Después, fotografíe la diapositiva usando una cámara digital en un transiluminador como fuente de luz blanca homogénea. La ubicación del tumor en la superficie CAM se visualizó bajo luz blanca y luz fluorescente tras la adición de hipericina. El análisis histológico mostró estructuras concéntricas de células escamosas anormales que invaden los tejidos sanos acompañados de edema y engrosamiento de la membrana.
Después del tratamiento con TFD, se observó una clara diferencia en la densidad de los vasos dentro del anillo y el área circundante. La radiación láser sin la presencia de fotosensibilizador no causó ningún daño comparable al control sin ningún tratamiento. Después de 3 horas de incubación con hipericina, la irradiación láser resultó en fluorescencia causada por la monomerización de la hipericina agregada con daño extenso a la vasculatura.
El análisis histológico reveló que la CAM de control no tratada tenía un grosor relativamente uniforme. Sin embargo, el tratamiento con TFD hizo que la CAM se volviera más delgada y frágil. Acabamos de demostrar cómo preparar el ensayo de codorniz ex ovo CAM y cómo usarlo.
Mientras se mantienen las pautas, esta metodología es fácil de dominar y puede obtener resultados rápidos.
