FreT de molécula única puede capturar la dinámica que ocurre a distancias nanométricas, que es la escala correcta para el proceso de biosíntesis de proteínas ribosómicas. El ribosoma funciona coordinando múltiples factores y componentes alostéricamente, lo que es intrínsecamente no homogéneo. El método de una sola molécula puede rastrear cada ribosoma sin estar limitado por este efecto promedio no homogéneo.
Este método revelará cómo los antibióticos inhiben la función del ribosoma para desarrollar nuevos medicamentos contra las infecciones bacterianas resistentes a los medicamentos. Comience por preparar el PRE mezclando la mezcla de iniciación EFTU, NOG y PAG en la proporción de uno a dos a 37 grados Celsius durante dos minutos. Después de la incubación, purifique el PRE usando ultracentrifugación de cojín de sacarosa molar 1.1 durante la noche a 100, 000 veces G.Prepare el POST mezclando la mezcla de iniciación EFTU, WG y PHE en una proporción de uno a dos a 37 grados Celsius durante 10 minutos.
Después de la incubación, purifique el POST usando un cojín de sacarosa molar 1.1 ultracentrifugación durante la noche a 100, 000 veces G.Limpie los portaobjetos de vidrio del microscopio que contienen seis pares de orificios de un milímetro de diámetro y las cubiertas de vidrio del microscopio número 1.5. Hornea los toboganes limpios y los cubreboganes a 300 grados centígrados durante tres horas, luego cubre el cobierno con aminosalina. En una campana laminar limpia, coloca una cubierta plana sobre la superficie.
Deje caer cuidadosamente 60 microlitros de solución de PEG en el borde superior, luego coloque otra cubierta sobre ella, dejando que el efecto capilar extienda la solución entre ellos asegurando que no se formen burbujas. Repita estos pasos para dos pares más de fundas. Guarde estos recuestos en una caja de punta vacía llena de agua e incube durante tres horas en la oscuridad.
Después de tres horas, separe los cubrecubres, enjuague con agua en tres crisoles consecutivos y purgue con una corriente de nitrógeno seco. Tire de las puntas de pipeta afiladas a través de los orificios de los portaobjetos de vidrio hasta que encajen bien. Raspe los extremos afilados hasta que estén completamente planos con la superficie de vidrio, luego corte una cinta de doble cara con el patrón de canal.
Pegue el en los toboganes de vidrio en el lado plano. Pegue la cubierta recubierta en la cinta de doble cara y presión sobre ella para hacer un sello hermético de la cámara de muestra, asegurándose de que el lado recubierto esté orientado hacia adentro. Encienda la computadora y el interruptor del microscopio.
Inicie la interfaz de control láser y encienda el láser. Presione el botón de activación en la caja de control del láser para calentar el láser. Encienda las cámaras y, a continuación, inicie el programa de software asociado al microscopio.
Haga clic en el obturador superior apagado y haga clic en la lámpara encendida. Prepare el TAM10 con el búfer Tween agregando 10 microlitros de 5%Tween-20 en un mililitro de búfer TAM10. Prepare la solución desoxi pesando tres miligramos de glucosa oxidasa en un pequeño tubo de microcentrífuga y agréguele 45 microlitros de catalasa.
Vórtice el tubo suavemente para disolver el sólido. Gire a 20, 000 veces G en una microcentrífuga durante un minuto y tome el sobrenadante. Prepare una solución de glucosa al 30%, una solución de Trolox de 200 milimolares y 0,5 miligramos por mililitro de solución de estreptavidina siguiendo las instrucciones del manuscrito de texto.
Agregue una gota de aceite de imagen al objetivo de césped. Coloque las cámaras de muestra en el objetivo. Llene la cámara con 10 microlitros de solución de estreptavidina y espere un minuto.
Lave la cámara con 30 microlitros de TAM10 con tampón Tween, recogiendo la solución de correntía con un papel de filtro doblado. Espere un minuto después del lavado. Diluya los complejos de ribosomas PRE o POST a concentraciones nanomolares de 10-15 con TAM10 con tampón Tween.
Cargue 20 microlitros de la muestra de ribosoma en el canal y espere dos minutos. Haga el tampón de imágenes utilizando 50 microlitros de tampón TAM10 y 0,5 microlitros cada uno de desoxiglucosa y solución Trolox. Mézclalos bien.
Enjuague la cámara con 30 mililitros del búfer de imágenes. Configure la cámara para adquirir imágenes. Haga clic en el obturador superior y apague la lámpara.
Inicie la adquisición de la cámara y difunda las imágenes en tres ventanas que representan dos cámaras individuales y la superposición. En el menú Adquirir, seleccione Capturar lapso de tiempo y luego haga clic en capturar automáticamente. Establezca el nombre de archivo apropiado, la ruta del archivo y el número de bucles y haga clic en ejecutar ahora.
Cierre la ventana emergente una vez que se complete la adquisición de la imagen y luego abra el archivo ND adquirido. Haga clic en ROI, editor de ROI simple y elija el círculo de opciones. Seleccione el ROI en la imagen y haga clic en finalizar cuando se complete.
Haga clic en medición, medición de tiempo para mostrar los datos como una gráfica o una hoja de cálculo. Abra la pestaña de exportación para establecer los parámetros de exportación, luego haga clic en exportar para guardar las intensidades. Finalmente, abra el archivo que se ha exportado utilizando una aplicación adecuada.
La distancia desde el residuo de etiquetado L27 hasta el ARNt del sitio A o del sitio P es de 61 o 52 angstrom respectivamente, lo que corresponde a una eficiencia FRET de 0.47 y 0.65. Las intensidades de florescencia de los canales donante y aceptor se recuperaron y se trazaron como lapsos de tiempo. Después del blanqueamiento del donante, ambos rastros se acercaron a la línea de base porque no se podía producir excitación directamente en el aceptor.
Después del blanqueamiento del aceptor, la intensidad del donante aumentó porque menos vías de reacción disiparon la energía de excitación. Los ribosomas individuales exhibieron diferentes fluctuaciones debido al movimiento tambaleante de los ARNet, lo que causó fluctuaciones de distancia al L27. Otros métodos como el ensayo de puromicina, el ensayo, el ensayo de impresión de dedos de dedos y la especificación de masa se complementan con el método FRET de molécula única y revelan más detalles sobre la síntesis de proteínas.
El FRET de una sola molécula tiene una amplia aplicación porque muchos procesos biológicos ocurren en el rango de nanómetros y en escalas de tiempo de milisegundos. Al etiquetar los tintes adecuados en las posiciones adecuadas, se pueden revelar muchas otras dinámicas.
