Muchos alérgenos se unen a moléculas hidrofóbicas. Este protocolo permite la eliminación y sustitución completa de estos ligandos, permitiéndonos estudiar su impacto sobre la estructura y la inmunogenicidad de forma sistemática. El uso de HPLC de fase inversa, junto con el recocido térmico, tiene dos ventajas.
Elimina los ligandos endógenos, y ayuda a solubilizar los ligandos para abrir sitios de unión de otra manera inaccesibles. Si podemos determinar los factores que contribuyen a la alergenicidad, podemos ser capaces de diseñar terapias que eviten estos factores. Muchas proteínas se unen a los ligandos lipídicos, que se retienen fuertemente y pueden influir tanto en la estructura como en la función.
Nuestro método permite el estudio sistemático de estas interacciones. La solubilidad y accesibilidad limitadas de muchas cargas lipídicas pueden inhibir el proceso de carga. Asegúrese de tener cuidado al preparar estos ligandos y de considerar la necesidad de adaptaciones específicas del sistema.
Como trabajar con ligandos hidrofóbicos e insolubles es un ajuste para algunos alergólogos y bioquímicos, puede ser útil ver cómo se ven las muestras en diferentes etapas. Después de la clonación de la expresión y purificación, aplique 12 mililitros del Bla g 1 escindido a una unidad de filtro centrífuga con un límite de peso molecular de menos de 10 kilodalton para múltiples centrifugaciones en un rotor de cubo oscilante hasta que el volumen total se haya reducido a menos de dos mililitros. Cargue el concentrado resultante en un sistema de HPLC de 250 por 10 milímetros equipado con una columna de cromatografía de fase inversa C18 equilibrada con un tampón A al 97% y un tampón B.Elute Bla g 1 al 1,5 a 4 mililitros por minuto, como se indica en la tabla, utilizando la absorbancia de fluorescencia a 280 nanómetros para monitorear el proceso de elución.
A partir de alrededor de 34 a 40 minutos y una concentración de tampón B por encima del 74% recoger no más de cuatro mililitros de cada Bla g 1 fracción. Alícuota la bla g agrupada 1 fracción en tubos de ensayo de vidrio. Cubra los tubos con película de parafina y perfore la película con dos agujeros.
Luego, congele las muestras a menos 80 grados Celsius durante una hora y use un liofilizador para secar las muestras de proteínas deslipiliadas resultantes. Para determinar el rendimiento anticipado de Bla g 1, vuelva a suspender una alícuota de prueba deslipemiada liofilizada en cinco mililitros de tampón de re-plegado. Calentar la mezcla en un casto de 500 mililitros que contenga 250 mililitros de agua a 95 grados centígrados en una placa caliente con agitación y vórtice intermitente.
Mantenga la solución a 95 grados durante 30 a 60 minutos antes de permitir que el baño de agua se equilibre lentamente a temperatura ambiente. Cuando la solución se haya enfriado, pase la mezcla de lípidos Bla g 1 recocida a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras para eliminar el material particulado, y use un nuevo filtro centrífugo con un corte de 10 kilodalton para intercambiar la proteína filtrada tres veces en PBS para eliminar cualquier ácido graso libre residual y disolvente orgánico. Luego, evalúe la concentración de proteína utilizando un ensayo de análisis de proteínas estándar para determinar el rendimiento anticipado para las alícuotas restantes de Bla g 1.
Para reconstituir el Apo-Bla g 1, vuelva a suspender las alícuotas Bla g 1 en cinco mililitros de tampón de refolding por alícuota, y recocido las muestras como se demuestra. Para cargar el Bla g 1 con fosfolípidos, agregue 10 miligramos de la carga deseada a un tubo de ensayo de vidrio y disuelva en cloroformo, y evapore el cloroformo para producir una película lipídica. Luego, agregue PBS al tubo para producir una concentración final de fosfolípidos de 20 milimolares.
Caliente el fosfolípido por encima de la temperatura de transición de fase de la carga lipídica para rehidratar la película lipídica, y el vórtice hasta que la solución se vuelva turbia. Luego, agregue la carga de lípidos fosfo para producir un exceso molar de ligandos de 20X en relación con Bla g 1 basado en el rendimiento anticipado. Se puede formar un precipitante.
Vórtice para mezclar antes de recocer la proteína como se demuestra. Para confirmar la eliminación de la carga o la carga por RMN de fósforo-31, utilice un filtro centrífugo para concentrar la muestra en más de 100 micromolares, como se ha demostrado. Prepare muestras de fosfolípidos de referencia de concentraciones conocidas en tampón de PBS como se indica, y diluya la referencia final de Bla g 1 a una relación 1:1 con tampón de colalato a un volumen total de aproximadamente 600 microlitros.
Utilice una sonda de banda ancha para adquirir espectros de RMN unidimensionales de 31 fósforos de las muestras de Bla g 1 solubilizadas y los estándares de fosfolípidos de referencia, y compare los espectros de RMN fosforados Bla g 1 31 con los obtenidos para las muestras de referencia de fosfolípidos para confirmar la eliminación de ligandos endógenos unidos y/o la unión de los ligandos deseados en función de los cambios químicos de los picos visibles, luego compare la intensidad máxima del espectro Bla g 1 con la de los estándares de referencia de fosfolípidos para permitir la confirmación de la estequiometría de unión completa. Usando la cromatografía de afinidad, GST recombinante Bla g 1 se puede aislar fácilmente a un alto nivel de pureza, produciendo un rendimiento de dos a cuatro miligramos por litro de cultivo celular. La incubación durante la noche con la proteasa tev a cuatro grados centígrados es suficiente para eliminar la etiqueta GST, produciendo el producto final en aproximadamente 24 kilodaltons.
La aplicación del Bla g 1 a una columna C18 de fase inversa produce un perfil de elución distintivo, con dos picos grandes en el 50% buffer B, y un segundo pico grande en el 75% buffer B.Phosphorus-31 espectros de RMN de Apo-Bla g 1 no muestran fosfolípidos detectables. Se puede producir una curva estándar a partir de la RMN utilizando muestras de referencia de concentraciones conocidas de DSPC. La comparación de la intensidad de la señal de fósforo 31 obtenida de DSPC Bla g 1 contra esta curva estándar se puede utilizar para producir la estequiometría de unión de los lípidos por proteína.
Espectros circulares del dicroísmo para Apo-y lípido-cargado Bla g 1 muestran mínimos de 220 y 210 nanómetros, indicativos de una estructura predominante alfa-helicoidal. Los ensayos de desnaturalización térmica basados en dicroísmo circular también muestran una pérdida cooperativa de estructura secundaria alfa-helicoidal, indicativa de un dominio globular plegado. Además, el análisis de las temperaturas de fusión resultantes revela un aumento significativo en la unión del ligando nMix, consistente con Bla g 1 obtenido de su fuente natural de alérgenos.
El éxito de este protocolo se basa en la capacidad de superar tanto la solubilidad limitada de los ligandos hidrofóbicos, como la naturaleza inaccesible de la cavidad de unión Bla g 1. Este procedimiento sienta las bases para que los estudios inmunológicos, tales como análisis de la proliferación del T-cell, evalúen el efecto de los ligands del lípido sobre la sensibilización y los mecanismos moleculares a través de los cuales esto ocurre. Acoplando este procedimiento con ensayos biofísicos adicionales, hemos demostrado que la unión de ligandos hidrofóbicos mejora la estabilidad bla g 1, con posibles implicaciones aguas abajo para la generación de epítopos y la alergenicidad.
