Este protocolo permite la entrega de campos eléctricos de pulso mediante electrónica flexible para estudiar sus efectos terapéuticos sobre el glioblastoma. Hacemos esto visualizando el microambiente tumoral in vivo con imágenes. La bioelectrónica se está integrando en este protocolo utilizando varios modelos diferentes de complejidad creciente para estudiar el efecto de los campos pulsantes sobre el cáncer.
Las técnicas de microfabricación presentadas en este trabajo también se pueden probar como un medio para tratar otros tipos de cáncer, incluidos los xenoinjertos derivados del paciente. Esto se mueve hacia la idea de la medicina de precisión adaptada para cada paciente individual. Estas sondas están hechas con técnicas de microfabricación estándar, por lo que la fabricación es sencilla y cualquier persona con una sala limpia puede hacerlas.
Para el patrón de electrodos de oro, deposite una capa de tres micrómetros de parileno C con un sistema de deposición de parileno colocando los portaobjetos de vidrio limpio en la cámara de deposición. Pese seis gramos de parileno C en un bote de aluminio, colóquelo en el horno, evacúe la máquina y comience la deposición con los parámetros descritos en el manuscrito. Cuando termine la deposición y la temperatura del vaporizador esté por debajo de 40 grados centígrados, apague el enfriador, vaporizador y horno.
Ventile la máquina y recoja las muestras. Escurra la capa de las muestras tratadas con plasma con una fotorresistencia negativa a 1.000 veces G durante 40 segundos. Exponga la fotorresistencia a través de una máscara que presenta el diseño de electrodo interdigitado.
Luego sumerja las muestras en un revelador libre de iones metálicos durante tres minutos para eliminar la fotorresistencia no expuesta. Para depositar una capa de adhesión de 20 nanómetros de cromo y una capa de oro de 300 nanómetros con un evaporador térmico, ventile la máquina evaporadora y recorte las muestras en la placa redonda superior con tornillos metálicos. Llene los crisoles dedicados respectivamente con cromo y oro.
Selle y evacúe la máquina e inicie la rotación del portamuestras. Seleccione el crisol que contiene cromo y aumente lentamente la corriente hasta que la tasa de deposición alcance 0,2 angstroms por segundo. Abra el obturador, espere hasta la deposición de 20 nanómetros de cromo, cierre el obturador y reduzca lentamente la corriente hasta cero miliamperios.
Seleccione el crisol que contiene oro y aumente lentamente la corriente hasta una tasa de deposición de 0,2 angstroms por segundo. Abra el obturador para evaporar el oro, espere hasta la deposición de 10 nanómetros de oro y luego aumente la tasa de deposición a 1.5 angstroms por segundo hasta que se depositen aproximadamente 300 nanómetros. Cierre el obturador y reduzca lentamente la corriente a cero miliamperios.
Sumerja las muestras en un vaso de precipitados que contenga acetona. Luego enjuague las muestras con isopropanol y séquelas con una pistola de aire comprimido. Capa de centrifugación de cuatro capas de solución PEDOT:PSS a 150 veces G durante 35 segundos.
Retire la capa C de parileno sacrificial sumergiendo las muestras en agua. Sumerja las muestras en agua desionizada durante 30 minutos para eliminar el jabón restante y los compuestos de bajo peso molecular en la película PEDOT:PSS y separe las muestras del sustrato de vidrio. Agregue 75 microlitros de solución fundida de agarosa al 1% en cada pocillo de la placa de 96 pocillos con cuidado y deje que se solidifique durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Separar las células de glioblastoma transducidas obtenidas durante la generación de la línea celular estable. Agregue 10, 000 células de glioblastoma por pocillo y complete el volumen total a 150 microlitros por pocillo usando DMEM que contiene un gramo por litro de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio, 10% de suero bovino fetal, 100 unidades por microlitros de penicilina y 100 microgramos por microlitros de estreptomicina. Reemplace la mitad del medio con medios nuevos cada dos días hasta nuevos experimentos mientras mantiene la punta de la pipeta en la parte superior del pozo para evitar daños a la agarosa o al esferoide en sí.
Coloque los huevos fertilizados de codorniz japonesa, Coturnix japonica, en una incubadora en bandejas con un rotador automático que gira los huevos cada dos horas. Este día se considera el día cero embrionario. En el tercer día embrionario, abra suavemente los huevos con una pinza con puntas delgadas prelavadas con etanol al 70%.
Vierta el embrión en un bote de pesaje de plástico, cúbralo con otro bote de pesaje y colóquelo en una incubadora humidificada estándar a 37 grados centígrados durante tres días. En el sexto día embrionario, hacer una pequeña incisión en la membrana corioalantoidea con una aguja de calibre 23. Coloque un esferoide de siete días en la incisión usando una pipeta y devuelva el embrión a la incubadora durante tres días hasta que se realicen más experimentos.
Coloque una gota de DPBS para cubrir la craneotomía. Coloque el electrodo flexible en la gota de DPBS y coloque suavemente la parte posterior de la sonda con las almohadillas de contacto en la parte posterior del mouse. Absorba la gota DPBS con un pequeño trozo de papel hasta que la sonda pueda colocarse plana sobre la duramadre y siga la curvatura del cerebro, asegurando que la pequeña capa de solución salina permanezca debajo de los electrodos para actuar como una barrera contra el derrame de pegamento.
Coloque una pequeña gota de adhesivo de silicona sobre la sonda y cúbrala con un vidrio de cubierta redonda de cinco milímetros. Empuje el vidrio de la cubierta hacia abajo hasta que la silicona se distribuya uniformemente y la distancia entre el vidrio de la cubierta y la sonda sea mínima. Luego espere 30 segundos para que la silicona se solidifique.
Para asegurar el vidrio de la cubierta, aplique rápidamente superglue en sus lados y empújelo hacia abajo hasta que el pegamento se vuelva sólido. Aplique súper pegamento en el cuello de la sonda con un palillo de dientes teniendo cuidado de que el súper pegamento se dibuje debajo del cuello para proporcionar un soporte estable. Cubra el cráneo con cemento dental para construir una tapa crónica y tenga especial cuidado de cubrir solo los bordes del vidrio de la cubierta.
Levante la parte posterior de la sonda y aplique cemento debajo del cuello de la sonda. Descanse la sonda sobre el cemento antes de que se cure. Empuje suavemente el cuello de la sonda para colocar su superficie al mismo nivel que el vidrio de la cubierta y no en el camino del objetivo del microscopio durante el experimento.
Cubra la parte superior del cuello de la sonda con no más de 1,5 milímetros de capa de cemento dental para lograr una sujeción firme de la sonda. Construya un pozo de cemento que presente una cresta de 1,5 milímetros de uno a dos milímetros alrededor del vidrio de la cubierta para crear un recipiente para el fluido de inmersión para las imágenes de dos fotones. Después de que el cemento se haya curado, administre analgesia postquirúrgica y mantenga al animal caliente hasta la recuperación envolviéndolo en una toalla de papel y colocándolo cerca de una bombilla infrarroja.
Los electrodos recubiertos con PEDOT:PSS muestran las regiones típicas dominadas capacitivas y resistivas separadas por una frecuencia de corte, mientras que los electrodos no recubiertos muestran solo un comportamiento capacitivo. El crecimiento de los esferoides observado con un microscopio de campo claro reveló que se necesitan al menos dos o tres días para obtener esferoides esféricos y densos dependiendo de la línea celular y el número de células sembradas. En el modelo in ovo, el injerto de esferoides en la membrana corioalantoidea se puede evaluar mediante microscopía de fluorescencia, ya que las células vivas tienen calcio intracelular y la vascularización del tumor se puede evaluar inyectando un tinte fluorescente en los vasos sanguíneos.
En comparación con la impedancia en solución salina, se espera un aumento de la impedancia in vivo a frecuencias superiores a 100 hercios debido a la presencia de un entorno biológico. El parénquima neural vascularizado y la infiltración tumoral pueden observarse y caracterizarse a través del sustrato transparente durante semanas mediante microscopía de dos fotones. El uso de animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en células de interés puede demostrar el proceso inflamatorio mínimo inducido por la implantación de electrodos solo.
Se puede mostrar la presencia de microglía y monocitos 26 días después de la implantación de campos eléctricos pulsados estimulados electrodo. Se encontraron células microgliales periféricas derivadas de monocitos y células microgliales resonantes cerebrales alrededor y dentro del tumor. El punto crítico para el éxito en el procedimiento de implante es garantizar el sellado y la planitud de la ventana craneal y optimizar la calidad del contacto con la sonda.
Además de la imagen intravital, lo que podríamos considerar combinar nuestro protocolo con otras medidas y técnicas como los muestreos y medidas de análisis de sangre para citoquinas, estado inmune por citometría de flujo, o incluso análisis de comportamiento. Este trabajo allana el camino para el uso de dispositivos implantables flexibles para el cáncer y abre nuevas perspectivas para el uso de la medicina bioelectrónica para esta enfermedad crónica.
