Este protocolo ofrece un método de administración de terapia génica a múltiples tejidos oculares de una manera segura, fácil y efectiva. También es adaptable para inyecciones intraestromales y subretinianas en animales pequeños. El uso de la vía subconjuntival de inyección es mínimamente invasivo.
Presenta menos riesgos y es muy prometedor para la administración AV para tratar múltiples enfermedades oculares. Con más de 1.000 millones de personas en todo el mundo que sufren de discapacidad visual, el uso de un método seguro y fácil para la administración de medicamentos ofrece una amplia aplicabilidad para el tratamiento de muchas causas diferentes de ceguera. Los métodos de administración de genes descritos en este protocolo son de particular interés para aquellos que están desarrollando posibles estrategias de intervención y oftalmólogos en ejercicio, que eventualmente administrarán estos medicamentos a los pacientes.
El mayor desafío para alguien que está realizando este protocolo por primera vez es probablemente la inserción de la aguja en el concepto de espacio conjuntival. Para comenzar, ensamble el sistema de inyección colocando un microscopio estereoscópico y una bomba de jeringa en un gabinete de bioseguridad. A continuación, corte el tubo de polietileno a una longitud de aproximadamente 50 centímetros.
Inserte el extremo de una aguja de calibre 36 en un extremo del tubo. Luego llene una jeringa desechable de 3 mililitros con agua estéril e insértela en el lado del tubo opuesto a la aguja. Enjuague el tubo tres veces, alternando entre agua estéril y alcohol al 70% para desinfectar el tubo y asegurarse de que no haya fugas, obstrucciones o daños en todo el tubo.
Usando la jeringa desechable de 3 mililitros, llene el tubo con agua estéril y deje el tubo conectado a la jeringa desechable. Luego coloque un trozo de espuma de paracho en la superficie del gabinete de bioseguridad y agréguele un charco de agua estéril. Sumerja la porción del tubo conectada a la aguja en el charco de agua estéril.
A continuación, saque la jeringa desechable de la abertura del tubo para evitar que entre aire en el sistema de tubos al retirar la jeringa. Luego llene una jeringa Hamilton de 10 microlitros con agua estéril. A continuación, conecte la aguja de la jeringa Hamilton al extremo abierto del tubo sumergiendo la punta de la aguja de la jeringa Hamilton en el charco de agua estéril en la película para.
Mantenga presionado el botón de retroceso rápido en la pantalla de la bomba para mover los bloques del empujador a la longitud aproximada de la jeringa. A continuación, desenrosque las perillas de sujeción del soporte para aflojar los soportes de retención en el empujador y los bloques del soporte de la jeringa. Posteriormente, cargue la jeringa Hamilton en el bloque del soporte de la jeringa y asegure la jeringa siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para ajustar los parámetros en la pantalla de configuración de la bomba, presione el botón "Forzar" y establezca el nivel de fuerza en 30%Luego acepte los cambios para volver a la pantalla de configuración. Presione el botón "Inicio rápido", seleccione Método y, a continuación, seleccione la opción Sólo infundir. Para la opción de jeringa, seleccione Hamilton 1700, luego haga clic en "Vidrio" y seleccione 10 microlitros.
Más tarde, seleccione la velocidad de infusión y el volumen de inyección. Expulse el agua de la jeringa Hamilton mientras deja el tubo y la aguja de inyección llenos de agua presionando el botón Infuse". A continuación, retire el virus colocando la aguja de inyección en una alícuota de la cepa de virus.
Luego, tire ligeramente hacia atrás de la jeringa Hamilton presionando el botón de retroceso para introducir una pequeña burbuja de aire en el tubo. Después de anestesiar al animal, agarre la conjuntiva con fórceps. Luego inserte la aguja en la conjuntiva hasta que el bisel esté completamente cubierto por la membrana conjuntival, y coloque la aguja contra el globo.
Simultáneamente, inicie la inyección presionando el botón "Start" con el interruptor de pie. Para examinar la distribución del vector AAV, los tejidos oculares y circundantes se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones sagitales representativas demostraron que la dispersión de la tinta china se produjo principalmente adyacente a los músculos extraoculares en la superficie externa de la esclerótica en los tejidos conectivos sueltos perioculares.
Para confirmar la transducción de AAV 8 autocomplementario a las ocho semanas después de la inyección, se examinó la abundancia de proteína de fluorescencia verde en las secciones transversales mediante tinción de inmunofluorescencia. Los resultados revelaron que los vectores AAV 8 transducieron eficientemente los músculos perioculares posteriores al ojo y la córnea. Para analizar la biodistribución del vector, se examinaron los números de copias del genoma del vector y los distintos compartimentos oculares en otros órganos, incluidos el hígado y el corazón, mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa utilizando cebadores y sondas específicas para el transgén.
La expresión del transgén se confirmó mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, que sugirió que la inyección subconjuntival de AAV 8 da como resultado la expresión transgénica en el párpado, la conjuntiva, la córnea y el nervio óptico. La burbuja de aire servirá como una barrera entre el agua en el tubo y el medicamento terapéutico. Esta técnica permite a otros investigadores explorar el uso de la vía de administración subconjuntival tanto para soluciones oftálmicas como para terapias génicas oculares para múltiples enfermedades.
