Bu protokol, çoklu oküler dokulara güvenli, kolay ve etkili bir şekilde gen terapisi verilmesi için bir yöntem sunar. Ayrıca küçük hayvanlarda intrastromal ve subretinal enjeksiyonlar için uyarlanabilir. Subkonjonktival enjeksiyon yolunun kullanımı minimal invazivdir.
Daha az risk oluşturur ve çoklu oküler hastalıkları tedavi etmek için AV dağıtımı için büyük umut vaat eder. Dünya çapında görme bozukluğundan muzdarip 1 milyardan fazla insanla, ilaç dağıtımı için güvenli ve kolay bir yöntem kullanmak, körlüğün birçok farklı nedeninin tedavisi için geniş uygulanabilirlik sunmaktadır. Bu protokolde açıklanan gen dağıtım yöntemleri, potansiyel müdahale stratejileri geliştiren ve sonunda bu ilaçları hastalara ulaştıracak olan göz doktorlarını uygulayanlar için özellikle ilgi çekicidir.
Bu protokolü ilk kez gerçekleştiren biri için en büyük zorluk, muhtemelen iğnenin kavram konjonktival boşluğuna sokulmasıdır. Başlamak için, bir biyo-güvenlik kabinine bir stereo mikroskop ve bir şırınga pompası yerleştirerek enjeksiyon sistemini monte edin. Daha sonra, polietilen boruyu yaklaşık 50 santimetre uzunluğa kadar kesin.
36 gauge'lik bir iğnenin ucunu borunun bir ucuna yerleştirin. Daha sonra tek kullanımlık 3 mililitrelik bir şırıngayı steril suyla doldurun ve iğnenin karşısındaki tüpün yanına yerleştirin. Boruyu dezenfekte etmek ve boru boyunca sızıntı, tıkanma veya hasar olmadığından emin olmak için steril su ve% 70 alkol arasında geçiş yaparak boruyu üç kez yıkayın.
Tek kullanımlık 3 mililitrelik şırıngayı kullanarak, boruyu steril suyla doldurun ve boruyu tek kullanımlık şırıngaya bağlı bırakın. Daha sonra biyo-güvenlik kabininin yüzeyine bir parça parafoam yerleştirin ve üzerine bir steril su havuzu ekleyin. İğneye bağlı borunun bir kısmını steril su havuzuna batırın.
Daha sonra, şırınganın çıkarılmasından sonra herhangi bir havanın boru sistemine girmesini önlemek için tek kullanımlık şırıngayı tüp açıklığından dışarı çekin. Ardından 10 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasını steril suyla doldurun. Daha sonra, Hamilton şırıngasının iğne ucunu para filmi üzerindeki steril su havuzuna batırarak Hamilton şırınga iğnesini borunun açık ucuna bağlayın.
İtici blokları şırınganın yaklaşık uzunluğuna taşımak için pompa ekranındaki hızlı geri vites düğmesini basılı tutun. Ardından, itici üzerindeki tutucu braketleri ve şırınga tutucu bloklarını gevşetmek için braket sıkma düğmelerini sökün. Daha sonra, Hamilton şırıngasını şırınga tutucu bloğuna yükleyin ve üreticinin talimatlarını izleyerek şırıngayı sabitleyin.
Pompa ayarı ekranındaki parametreleri ayarlamak için "Kuvvet" düğmesine basın ve kuvvet seviyesini %30 olarak ayarlayın, ardından ayar ekranına geri dönmek için değişiklikleri kabul edin. Hızlı Başlat" düğmesine basın, Yöntem'i seçin ve ardından Yalnızca Demle" seçeneğini belirleyin. Şırınga seçeneği için Hamilton 1700'ü seçin, ardından Cam'a tıklayın ve 10 mikrolitre seçin.
Daha sonra, infüzyon hızını ve enjeksiyon hacmini seçin. Suyu Hamilton şırıngasından çıkarın ve Demleyin" düğmesine basarak boru ve enjeksiyon iğnesini suyla dolu bırakın. Daha sonra, enjeksiyon iğnesini virüs stokunun bir aliquot'una yerleştirerek virüsü geri çekin.
Ardından, boruya küçük bir hava kabarcığı sokmak için geri düğmesine basarak Hamilton şırıngasını hafifçe geri çekin. Hayvanı anestezi uyguladıktan sonra, konjonktivayı forseps ile tutun. Daha sonra konjonktiva içine konjonktiva içine konvokal konjonktiva içine yerleştirin ve iğneyi dünyaya karşı yerleştirin.
Aynı anda, ayak düğmesini kullanarak Başlat düğmesine basarak enjeksiyonu başlatın. AAV vektörünün dağılımını incelemek için, oküler ve çevre dokular hematoksilin ve eozin ile boyandı. Temsili sagital bölümler, Hindistan mürekkebinin dağılımının esas olarak perioküler gevşek bağ dokularındaki skleranın dış yüzeyindeki ekstraoküler kaslara bitişik olarak gerçekleştiğini göstermiştir.
Enjeksiyondan sekiz hafta sonra kendi kendini tamamlayan AAV 8'in transdüksiyonunu doğrulamak için, kesitlerdeki yeşil floresan protein bolluğu immünofloresan boyama ile incelendi. Sonuçlar, AAV 8 vektörlerinin perioküler kasları posterior olarak göze ve korneaya verimli bir şekilde dönüştürdüğünü ortaya koydu. Vektör biyo-dağılımını analiz etmek için, vektör genom kopya numaraları ve karaciğer ve kalp de dahil olmak üzere diğer organlardaki farklı göz bölmeleri, transgene özgü primerler ve problar kullanılarak kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ile incelendi.
Transgenin ekspresyonu, AAV 8'in subkonjonktival enjeksiyonunun göz kapağında, konjonktivada, korneada ve optik sinirde transgen ekspresyonuyla sonuçlandığını öne süren kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile doğrulandı. Hava kabarcığı, tüpteki su ile terapötik ilaç arasında bir bariyer görevi görecektir. Bu teknik, diğer araştırmacıların hem oftalmik çözümler hem de çoklu hastalıklar için oküler gen terapileri için subkonjonktival uygulama yolunun kullanımını keşfetmelerini sağlar.
