이 프로토콜은 안전하고 쉽고 효과적인 방식으로 여러 안구 조직에 유전자 요법을 전달하는 방법을 제공합니다. 또한 작은 동물의 기질 내 및 망막 하 주사에도 적용 할 수 있습니다. 결막 하 주사 경로의 사용은 최소 침습적입니다.
그것은 더 적은 위험을 제기하고 여러 안구 질환을 치료하기 위한 AV 전달에 대한 큰 약속을 가지고 있습니다. 전 세계적으로 10억 명이 넘는 사람들이 시각 장애로 고통받고 있는 상황에서 안전하고 쉬운 약물 전달 방법을 사용하면 다양한 실명 원인 치료에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명 된 유전자 전달 방법은 잠재적 인 개입 전략을 개발하고 안과 의사를 개업하는 사람들에게 특히 관심이 있으며, 결국 이러한 약물을 환자에게 전달할 것입니다.
이 프로토콜을 처음 수행하는 사람에게 가장 큰 도전은 개념 결막 공간에 바늘을 삽입하는 것입니다. 시작하려면 실체 현미경과 주사기 펌프를 생물 안전 캐비닛에 넣어 주입 시스템을 조립하십시오. 다음으로 폴리에틸렌 튜브를 약 50cm 길이로 자릅니다.
36게이지 바늘의 끝을 튜브의 한쪽 끝에 삽입합니다. 그런 다음 일회용 3 밀리리터 주사기에 멸균 수를 채우고 바늘 반대쪽 튜브 측면에 삽입하십시오. 멸균수와 70% 알코올을 번갈아 가며 튜브를 세 번 세척하여 튜브를 소독하고 튜브 전체에 누출, 막힘 또는 손상이 없는지 확인합니다.
일회용 3 밀리리터 주사기를 사용하여 튜브에 멸균 수를 채우고 튜브를 일회용 주사기에 부착 된 상태로 둡니다. 그런 다음 생물 안전 캐비닛 표면에 파라폼 조각을 놓고 멸균 수 풀을 추가하십시오. 바늘에 연결된 튜브 부분을 멸균 수 웅덩이에 담그십시오.
그런 다음 주사기를 꺼낼 때 공기가 튜브 시스템으로 들어가는 것을 방지하기 위해 튜브 입구에서 일회용 주사기를 빼냅니다. 그런 다음 10 마이크로 리터 해밀턴 주사기에 멸균 수를 채 웁니다. 다음으로, 해밀턴 주사기의 바늘 끝을 파라 필름의 멸균수 풀에 담그어 해밀턴 주사기 바늘을 튜브의 열린 끝에 연결합니다.
펌프 화면의 빠른 역방향 버튼을 길게 눌러 푸셔 블록을 주사기의 대략적인 길이로 이동합니다. 그런 다음 브래킷 클램핑 손잡이의 나사를 풀어 푸셔와 주사기 홀더 블록의 고정 브래킷을 풉니다. 그런 다음 Hamilton 주사기를 주사기 홀더 블록에 로드하고 제조업체의 지침에 따라 주사기를 고정합니다.
펌프 설정 화면에서 매개변수를 조정하려면 힘" 버튼을 누르고 힘 수준을 30%그런 다음 변경 사항을 수락하여 설정 화면으로 돌아갑니다. 빠른 시작" 버튼을 누르고 방법을 선택한 다음 주입만" 옵션을 선택합니다. 주사기 옵션의 경우 Hamilton 1700을 선택한 다음 "유리"를 클릭하고 10 마이크로 리터를 선택하십시오.
나중에 주입 속도와 주입량을 선택하십시오. Infuse" 버튼을 눌러 튜브와 주입 바늘에 물이 가득 찬 상태로 두고 Hamilton 주사기에서 물을 배출합니다. 다음으로, 주사 바늘을 바이러스 스톡의 분취량에 넣어 바이러스를 회수합니다.
그런 다음 역방향 버튼을 눌러 해밀턴 주사기를 약간 뒤로 당겨 튜브에 작은 기포를 넣습니다. 동물을 마취 한 후 집게로 결막을 잡으십시오. 그런 다음 경사가 결막으로 완전히 덮일 때까지 바늘을 결막에 삽입하고 바늘을 지구본에 대십시오.
동시에 풋 스위치를 사용하여 시작"버튼을 눌러 주입을 시작하십시오. AAV 벡터의 분포를 조사하기 위해, 안구 및 주변 조직을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 대표적인 시상 절편은 인도 잉크의 분산이 주로 안구 주위의 느슨한 결합 조직에서 공막의 외부 표면에있는 외안근에 인접하여 발생했음을 입증했다.
주사 후 8주에 자가-보완 AAV 8의 형질도입을 확인하기 위해, 단면의 녹색 형광 단백질 풍부도를 면역형광 염색에 의해 조사하였다. 결과는 AAV 8 벡터가 눈과 각막 뒤쪽의 안구 주위 근육을 효율적으로 전달한다는 것을 밝혀냈다. 벡터 생체 분포를 분석하기 위해 간 및 심장을 포함한 다른 장기의 벡터 게놈 복제 수와 별개의 눈 구획을 전이 유전자에 특이적인 프라이머와 프로브를 사용하여 정량적 중합 효소 연쇄 반응으로 검사했습니다.
전이유전자의 발현은 정량적 역전사 중합효소연쇄반응에 의해 확인되었으며, 이는 AAV 8의 결막하 주사가 눈꺼풀, 결막, 각막 및 시신경에서 전이유전자 발현을 초래함을 시사하였다. 기포는 튜브의 물과 치료 약물 사이의 장벽 역할을합니다. 이 기술을 통해 다른 연구자들은 여러 질병에 대한 안과 용액과 안구 유전자 요법 모두에 대한 결막 하 투여 경로의 사용을 탐색 할 수 있습니다.
